楊軍峰 趙 璞 張 全 務(wù) 森

(河南省人民醫(yī)院胸外科 ，河南 鄭州 450000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率和病死率占惡性腫瘤的首位〔1〕。人第10號(hào)染色體確實(shí)的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)在肺癌磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路中起重要的調(diào)節(jié)作用，其蛋白表達(dá)缺失與NSCLC不良預(yù)后相關(guān)〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，3.8%的NSCLC患者的PTEN基因在RNA水平存在大片段缺失，而且大部分缺失與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)敏感突變共存，表明PTEN缺失在NSCLC發(fā)生、發(fā)展、治療中不是一種孤立現(xiàn)象，但其失活機(jī)制及在通路中的作用仍未闡明〔4〕。本研究擬分析PTEN缺失與PI3K抑制劑對(duì)NSCLC細(xì)胞系的作用關(guān)系，旨在闡釋PTEN缺失的分子機(jī)制，為絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抑制劑的臨床應(yīng)用篩選合適的分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑 H1793細(xì)胞〔美國(guó)物種保存中心(ATCC)〕;PI3K抑制劑GSK2636771(美國(guó)MCE公司)；總RNA提取試劑盒(上海超研生物科技有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；抗體磷酸化(p)-EGFR、p-AKT、P-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(美國(guó)CST公司)；PTEN探針RP11-846G17(多倫多應(yīng)用基因?qū)W，加拿大，光譜標(biāo)記)；pBP-PTEN質(zhì)粒(武漢淼靈生物科技有限公司)；DH5α大腸桿菌菌株(本院保存)。其他試劑均為分析純國(guó)產(chǎn)試劑。

1.2主要儀器 超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，精密電子天平(Adventurer公司，美國(guó))，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)，紫外分光光度計(jì)(Nano Drop公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 用含100 U/ml青霉素、鏈霉素及10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。

1.4基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定 將真核表達(dá)載體pBP-PTEN轉(zhuǎn)化DH5α菌株，克隆并擴(kuò)增，提取并純化質(zhì)粒DNA。酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1793細(xì)胞，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pBP-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H1793細(xì)胞。挑選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。將成功轉(zhuǎn)染pBP-PTEN質(zhì)粒的H1793細(xì)胞命名為H1793-pBP-PTEN細(xì)胞。

1.5熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)PTEN表達(dá)情況 采用PTEN探針RP11-846G17(標(biāo)記紅色熒光)，按標(biāo)準(zhǔn)FISH操作流程進(jìn)行檢測(cè)。玻片56℃孵育24 h，常規(guī)脫蠟、脫水，于80℃檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中50 min，SSC漂洗；消化后繼續(xù)孵育10 min，梯度灑精脫水，80℃變性后加入探針，37℃過夜，室溫SSC沖洗2 min，水洗，鏡檢。

1.6分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、糖原合成酶(GSK)低劑量組(10 μmol/L)、GSK中劑量組(20 μmol/L)和GSK高劑量組(30 μmol/L)。

1.7MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 配制5 mg/ml的MTT溶液；96孔細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h檢測(cè)MTT，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；檢測(cè)時(shí)每孔更換180 μl RMPI1640培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液；37℃孵育4 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基。每孔加入二甲基亞礬(DMSO)150 μl，振搖10 min，490 nm處酶標(biāo)儀測(cè)量OD值。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 配備10～50 μmol/L 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)溶液，加1/10 DAPI于細(xì)胞中，37℃，10～20 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。用熒光顯微鏡(EX 360 nm，EM 460 nm)觀察。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡指數(shù)：把處理的細(xì)胞消化、中和、離心、PBS洗2遍，離心去上清，250 μl結(jié)合緩沖液重懸，取100 μl加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 10 μl,避光室溫15 min后加入PBS 400 μl上機(jī)；將Annexin V-FITC/PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1 μg/ml，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min 離心5 min；用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次；加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃孵育20 min，避光并振動(dòng)；流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，用波長(zhǎng)515 nm的通帶濾器檢測(cè)異硫氰酸熒光素(FITC)熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm 的濾器檢測(cè)PI。細(xì)胞凋亡情況應(yīng)用Cell Quest 軟件進(jìn)行分析。

1.9Western印跡法檢測(cè) EGFR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組預(yù)處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取蛋白。取35 μg蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，將膜轉(zhuǎn)入一抗(p-EG-FR、 p-AKT、p-mTOR)稀釋液中4℃過夜，PBS洗3次，對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，顯影。

1.10統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PTEN表達(dá)情況 PTEN定位于細(xì)胞核內(nèi)，在H1793細(xì)胞內(nèi)為陰性表達(dá)，在H1793-pBP-PTEN細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，顯紅色熒光，證實(shí)PTEN成功轉(zhuǎn)入H1793細(xì)胞并獲得表達(dá)。見圖1。

圖1 PTEN的表達(dá)(×400)

2.2PI3K抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響 PI3K抑制劑作用72 h后，相同濃度PI3K抑制劑對(duì)H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的抑制率比較存在顯著性差異(P<0.05)。GSK高劑量組對(duì)H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的抑制率高于GSK低劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組對(duì)H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的抑制率高于GSK低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 PI3K抑制劑作用72 h后的A值和抑制率

與GSK高劑量組比較：1)P<0.05；與GSK中劑量組比較：2)P<0.05

2.3PI3K抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 處理48 h后GSK低、中和高劑量組H1793細(xì)胞株凋亡率分別為8.22%、12.12%和18.93%，H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株凋亡率分別為18.29%、26.83%和39.67%。相同濃度PI3K抑制劑作用下，H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的凋亡率比較差異顯著(P<0.05)。GSK高劑量組對(duì)H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的凋亡率高于GSK低劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組對(duì)H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株的凋亡率高于GSK低劑量組。

2.4PI3K抑制劑對(duì)信號(hào)通路的影響 隨著PI3K抑制劑濃度增加，H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株 p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均下降，且H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著低于H1793細(xì)胞株(P<0.05)。GSK低劑量組H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均高于GSK中劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組H1793細(xì)胞株和H1793-pBP-PTEN細(xì)胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均高于GSK高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 PI3K抑制劑對(duì)信號(hào)通路的影響

與H1793細(xì)胞株比較:1)P<0.05；與GSK高劑量組比較：2)P<0.05；與GSK中劑量組比較：3)P<0.05

3 討 論

著名的吉非替尼(易瑞沙)泛亞洲研究(IPASS)為肺癌靶向治療樹立了里程碑，EGFR突變型NSCLC患者采用小分子酪氨酸激酶抑制劑靶向治療臨床療效十分顯著〔5〕。研究顯示，靶向藥克唑替尼對(duì)微管相關(guān)類蛋白樣(EML)4間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因突變的NSCLC患者同樣效果顯著。由此可見，基于分子靶點(diǎn)的靶向抑制劑治療已發(fā)展成肺癌“個(gè)體化”治療的有效模式，EGFR突變型肺癌、EML4-ALK融合型肺癌做為明確的肺癌分子亞型，單一的病理分型已不能滿足臨床需要〔6〕。驅(qū)動(dòng)因子及其分子機(jī)制研究在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中取得喜人的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多藥物治療靶點(diǎn)，為NSCLC治療提供多種選擇。

國(guó)內(nèi)外均報(bào)道了NSCLC的基因突變譜，50%的肺腺癌伴有驅(qū)動(dòng)基因的突變，為NSCLC的靶向治療提供了分子基礎(chǔ)〔7〕。有報(bào)道稱，在50%的NSCLC患者中含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)1擴(kuò)增、盤狀結(jié)構(gòu)域受體(DDR)2突變或PIK3CA 突變/PTEN缺失，提示這幾個(gè)基因可能是NSCLC發(fā)生、發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因子，也可能成為靶向藥物治療的靶點(diǎn)〔8〕。EGFR是目前倍受矚目的腫瘤治療靶點(diǎn)。EGFR通過RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路和PI3K/AKT兩條通路參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，這兩條通路的失調(diào)控可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PTEN基因包含一個(gè)與脂質(zhì)結(jié)合的C2區(qū)，一個(gè)氨基端磷酸酶區(qū)域和一個(gè)羧基端區(qū)域。PTEN基因cDNA 5′末端存在著由近804個(gè)核苷酸組成的非翻譯區(qū)，并含有許多基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG雙核苷酸島結(jié)構(gòu)，可為其發(fā)生DNA甲基化提供可能〔9，10〕。

本研究顯示，PI3K抑制劑GSK2636771可顯著抑制H1973細(xì)胞增殖，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。H1973 細(xì)胞為PTEN表達(dá)缺失的肺癌細(xì)胞株，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法成功將pBP-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H1973腫瘤細(xì)胞，PI3K抑制劑的抑制細(xì)胞增殖和促凋亡作用得到增強(qiáng)，提示PTEN在PI3K抑制劑抗腫瘤作用中扮演重要角色，其表達(dá)缺失預(yù)示著肺癌H1973 細(xì)胞對(duì)PI3K抑制劑不敏感。因此，檢測(cè)NSCLC患者PTEN基因表達(dá)水平對(duì)評(píng)估PI3K抑制劑治療療效及預(yù)后有重要意義。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路通過調(diào)控下游分子，參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔11，12〕。作為一個(gè)抑癌基因，PTEN可抑制腫瘤的進(jìn)展，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)作用。PTEN的磷酸化區(qū)域是腫瘤抑制子活性區(qū)，但其關(guān)鍵作用是脂磷酸化作用，而不是蛋白磷酸化作用〔13〕。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTEN主要通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PIP3從而阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑癌作用，故有學(xué)者將其稱為PTEN-PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔14〕。此外，AKT是PTEN的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)，PTEN缺失是AKT失調(diào)控的一個(gè)重要原因。AKT的活化在肺癌的形成和進(jìn)展中起重要作用，因此，AKT是腫瘤治療的靶點(diǎn)〔15，16〕。本研究結(jié)果顯示，PI3K抑制劑對(duì)H1793-pBP-PTEN細(xì)胞株P(guān)I3K/AKT/mTOR信號(hào)抑制作用更明顯。