李 霞 王立志

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

偏頭痛現(xiàn)代醫(yī)學(xué)又稱為原發(fā)性血管性頭痛，為功能性頭痛的一種，是一組反復(fù)發(fā)作的慢性疾病。偏頭痛的發(fā)生與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平有著密切的關(guān)系，特別是5-羥色胺(HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)。大腦內(nèi)源性5-HT、NE及DA與其相應(yīng)的自身受體結(jié)合，影響機(jī)體的各種生理活動，并對進(jìn)一步的遞質(zhì)代謝起調(diào)節(jié)作用。在偏頭痛發(fā)作過程中的不同階段，腦內(nèi)不同神經(jīng)遞質(zhì)呈現(xiàn)出升高、降低的相應(yīng)變化規(guī)律。頭風(fēng)靈顆粒由白芷、川芎、五味子組成，是在臨床基礎(chǔ)上總結(jié)出來的經(jīng)驗方,有較好的療效。本研究采用硝酸甘油注射誘導(dǎo)實驗性偏頭痛大鼠模型，觀察頭風(fēng)靈顆粒對偏頭痛大鼠痛覺的影響及其鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級Wistar大鼠，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXK(吉)-2010-0001。ICR 小鼠，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2藥品與試劑 頭風(fēng)靈顆粒(自制)；阿司匹林(阿斯利康制藥有限公司)；乙酸(北京化工廠)；硝酸甘油(山東圣魯制藥有限公司)；西比靈(西安楊森)；氯化鈉注射液(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司)；一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒、降鈣素相關(guān)基因肽(CGRP)試劑盒、NE試劑盒、5-HT試劑盒，均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3儀器 電子天平(ES500-2型，沈陽亮衡天平儀器有限公司)；智能熱板儀(YLS-6A，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)。

1.4方法

1.4.1硝酸甘油致大鼠偏頭痛的實驗方法

1.4.1.1實驗分組及方法 取體重為180～220 g的Wistar大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組(予生理鹽水0.5 ml)、模型組(予硝酸甘油)、陽性組(予西比靈0.9 mg/kg)、頭風(fēng)靈顆粒高劑量(7.2 g/kg)組、中劑量(3.6 g/kg)組、低劑量(1.8 g/kg)組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7 d，空白組與模型組灌胃給予蒸餾水，于末次給藥后30 min開始復(fù)制偏頭痛動物模型。除空白組外，各組按10 mg/kg皮下注射硝酸甘油注射液，空白組皮下注射生理鹽水〔9,10〕。

1.4.1.2大鼠血漿NO、NOS及CGRP的檢測 大鼠皮下注射硝酸甘油4 h后，20%烏拉坦麻醉，腹主動脈取血，4℃ 1 000 r/min，離心5 min，分離血漿，-80℃保存，采用酶聯(lián)免疫分析法按試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.4.1.3大鼠腦組織NE、5-HT測定 大鼠皮下注射硝酸甘油4 h后，20%烏拉坦麻醉，冰臺上取腦組織，0.9%氯化鈉溶液洗去表面浮血，取0.5 g腦組織加0.9%氯化鈉溶液制備10%腦組織勻漿，-80℃保存，采用酶聯(lián)免疫分析法按照試劑盒說明測定腦組織NE、5-HT的含量〔12〕。

1.4.2頭風(fēng)靈顆粒的鎮(zhèn)痛作用 采用醋酸致小鼠扭體法、熱板法為鎮(zhèn)痛模型,考察頭風(fēng)靈的鎮(zhèn)痛作用。

1.4.2.1熱刺激小鼠痛閾值的實驗方法 取體重為15～17 g的雌性 ICR 小鼠90只，分別放在(55.0±0.5)℃智能熱板儀上測正常痛閾值，以小鼠舔后足、踢腿、跳躍為基礎(chǔ)痛閾?；A(chǔ)痛閾值控制在10～30 s，不滿足條件者被淘汰。取痛閾值10～30 s的小鼠72只，隨機(jī)分為空白組、生理鹽水組(予生理鹽水0.5 ml)、陽性對照組(予阿司匹林130 mg/kg)，頭風(fēng)靈顆粒高劑量(2 140 mg/kg)組、中劑量(1 052 mg/kg)組、低劑量(526 mg/kg)組，每組12只。在第3天給藥60 min后測定各組小鼠的痛閾值。開始計時，觀察小鼠出現(xiàn)舔后足的反應(yīng)再停止計時，這段時間為該只小鼠給藥后的痛閾。在熱板鎮(zhèn)痛實驗中，為了避免小鼠后足被燙傷，確定60 s為中斷時間，超過60 s者按照60 s計。熱板鎮(zhèn)痛實驗給藥后痛閾值超過給藥前50%以上者認(rèn)為有鎮(zhèn)痛作用。

1.4.2.2醋酸致小鼠扭體的實驗方法 取體重16～18 g的ICR 小鼠72只，雌雄各半，隨機(jī)分組同1.4.2.1，每組12只。各組小鼠在第3天給藥60 min后，腹腔注射0.6%醋酸0.01 ml/g。觀察并記錄注射醋酸和小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計算抑制率(%)=(對照組平均扭體次數(shù)-實驗組平均扭體次數(shù))/對照組平均扭體次數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS13.0軟件，組間比較進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗,組內(nèi)進(jìn)行配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1對硝酸甘油致偏頭痛的影響

2.1.1頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠撓頭次數(shù)的影響 與空白組比較，模型組在0～120 min內(nèi)撓頭次數(shù)均明顯增加(均P<0.001)，證明造模成功。31～60 min，頭風(fēng)靈中、低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；91～120 min，頭風(fēng)靈中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.01)。見表1。說明頭風(fēng)靈能夠明顯抑制硝酸甘油致大鼠撓頭次數(shù)增加，對實驗性偏頭痛有鎮(zhèn)痛作用。

表1 頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠撓頭次數(shù)的影響

與正常組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01,5)P<0.001

2.1.2頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠血漿NO、NOS及CGRP水平的影響 與空白組比較，模型組NO，NOS，CGRP水平顯著升高(均P<0.01)，證明造模成功。頭風(fēng)靈高、中、低劑量組NO含量較模型組有不同程度的抑制(P<0.01，P<0.001，P<0.001)，頭風(fēng)靈中、低劑量組NOS含量較模型組有不同程度的抑制(均P<0.001)，頭風(fēng)靈中劑量組CGRP含量較模型組有顯著差異(P<0.01)。見表2。

2.1.3頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠腦組織NE、5-HT的影響 與空白組比較，模型組5-HT顯著降低(P<0.05)；NE略降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。頭風(fēng)靈高劑量組NE含量較模型組升高(P<0.01)，頭風(fēng)靈高、中劑量組5-HT含量較模型組升高(P<0.05)。見表3。

2.2頭風(fēng)靈顆粒對小鼠的鎮(zhèn)痛作用

2.2.1對熱刺激小鼠痛閾值的影響(熱板法) 給藥前各組間小鼠熱板痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，給藥后小鼠熱板痛閾值與用藥前及生理鹽水組相比顯著延長(P<0.01)，陽性對照組、頭風(fēng)靈低、中、高劑量組痛閾提高百分率分別為40.91%、58.93%、60.08%、80.84%。見表4。

2.2.2對醋酸致小鼠扭體的影響 小鼠扭體反應(yīng)的表現(xiàn)為身體拉長，腹部肌肉張力增高，前肢伸展，并伴有一側(cè)或兩側(cè)后肢伸直。腹腔注射醋酸，部分小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)。醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)，在給藥后能夠得到有效抑制；且與生理鹽水組比較，小鼠扭體次數(shù)在給藥后明顯減少(P<0.01)。見表5。

表2 頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠NO，NOS，CGRP含量的影響

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01,3)P<0.001

表3 頭風(fēng)靈顆粒對硝酸甘油致偏頭痛大鼠NE，5-HT含量的影響

與空白組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

表4 頭風(fēng)靈顆粒對小鼠熱板法痛閾值的影響

與給藥前比較：1)P<0.01；與生理鹽水組比較：2)P<0.01

表5 頭風(fēng)靈顆粒對小鼠扭體次數(shù)的影響

與生理鹽水組比較：1)P<0.01

3 討 論

NO被普遍認(rèn)為是引起原發(fā)性頭痛的觸發(fā)物〔1〕，在偏頭痛患者外周血中可檢測到NO 水平升高〔2〕；NO 釋放可擴(kuò)張腦膜血管并激活神經(jīng)元〔3〕，進(jìn)而增加痛覺的傳導(dǎo)，導(dǎo)致中樞敏化〔4〕。NO 由NOS產(chǎn)生，NO 信號傳導(dǎo)激活可溶性鳥苷環(huán)化酶(sGC)產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP)，進(jìn)而引起蛋白激酶的磷酸化。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)可檢測到來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的NO，NO 可促使CGRP 和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，進(jìn)而引起血管擴(kuò)張或神經(jīng)信號的傳遞〔5〕；反過來，CGRP 使血管的eNOS 活化產(chǎn)生NO，NO 彌散入血管平滑肌激活鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cGMP 形成，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，引起血管舒張〔6〕。5-HT 是偏頭痛重要的神經(jīng)遞質(zhì)，目前很多抗偏頭痛藥物都是通過作用于5-HT 受體起作用的〔7〕。曲坦類藥物為選擇性的5-HT1B/1D 受體激動劑，能有效控制偏頭痛急性發(fā)作，已成為治療偏頭痛急性發(fā)作最有效的一線藥物。NE廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，在偏頭痛患者發(fā)作期和間歇期存在異常表現(xiàn)。謝煒等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，無先兆偏頭痛的患者發(fā)作期血漿5-HT、NE含量低于正常對照組，治療后血漿DA和NE均與治療前有顯著性差異。

本實驗顯示，頭風(fēng)靈能明顯改善偏頭痛動物模型的行為學(xué)癥狀，減少動物的陽性反應(yīng)次數(shù)，具有一定的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用。

本研究還提示，皮下注射硝酸甘油后血漿NOS、NO、CGRP含量升高，頭風(fēng)靈能夠明顯抑制硝酸甘油所致大鼠NO、NOS含量升高，對CGRP含量顯著抑制。頭風(fēng)靈能夠通過改善大鼠血管活性物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)水平失常，減弱神經(jīng)性炎癥，改善血管舒縮功能障礙，從而緩解偏頭痛癥狀。本實驗結(jié)果表明，頭風(fēng)靈顆粒能顯著延長小鼠熱板痛閾時間，有效減少醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)；既對中樞神經(jīng)有鎮(zhèn)痛作用，對外周神經(jīng)也有鎮(zhèn)痛作用，并與劑量有一定的關(guān)系，為今后的進(jìn)一步研究提供了可靠的依據(jù)。