郝 健 許麗萍 呂鐵鋼

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

造影劑腎病(CIN)主要是由于使用含碘造影劑(CM)而引起的急性腎損傷，通常伴隨血清肌酐(Scr)在48～72 h內(nèi)較基礎值顯著上升25%或增加0.5 mg/dl(44 μmol/L)〔1～3〕。研究報道，腎小管上皮細胞凋亡是CM致腎損傷和腎衰竭的主要原因〔4〕。彭炎強等〔5〕研究表明，姜黃素能夠通過其抗氧化活性來預防CM對大鼠腎小管上皮細胞損傷，從而預防CIN發(fā)生。Yue等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(MyD)88信號通路減輕CM引起的急性腎損傷。此外，龔學忠等〔7〕研究報道，制大黃-川芎藥對能通過p38/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制腎小管上皮細胞凋亡進而保護CIN大鼠腎功能。本研究通過CIN大鼠模型來進一步揭示制大黃-川芎藥對緩解CM引起的腎損傷的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性SD大鼠24只，體重(200±20)g購自中科院上海實驗動物中心；消炎痛、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)均購自Sigma公司；碘海醇(iohexol)購自通用電氣藥業(yè)公司；原位末端標記(TUNEL)試劑盒購自美國Roche公司；Bcl-2、Bax、TLR4、Myd88、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體購自CST公司；白細胞介素(IL)-6、IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自上海依科賽公司；中藥制大黃、川芎購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥房，水煎濃縮成每毫升含生藥2.25 g備用。

1.2CIN大鼠模型構(gòu)建 大鼠隨機分為3組，正常對照組(Control組)、CIN模型組(CIN組)、制大黃-川芎藥對組(Drug pair組)。Drug pair組于造模前每日行20倍成人標準體重(60 kg)常規(guī)用量的制大黃-川芎水煎液灌胃，連續(xù)灌胃7 d；Control組、CIN組分別于造模前行等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃7 d。7 d后，CIN組和Drug pair組進行CIN模型構(gòu)建：尾靜脈注射消炎痛(10 mg/kg)，15 min后注射L-NAME(10 mg/kg)，15 min 后注射適量350 mg/ml的碘酒(2 g/kg)，Control組注射等體積的PBS。動物手術(shù)實驗均在相應規(guī)章制度下進行，并均獲得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會的批準。

1.3大鼠腎功能指標檢測 造模后24 h后，尾靜脈取血并分離血清，采用全自動生化分析儀測定Scr和尿素氮(BUN)；稱量大鼠體重并記錄，處死大鼠，取腎組織并稱重，計算各組大鼠腎指數(shù)。

1.4TUNEL染色 取腎組織固定，石蠟包埋，切片，脫蠟、水合，蛋白酶K處理，加入適量TUNEL工作液，加底物顯色顯微鏡下觀察，細胞核呈棕黃色為凋亡細胞，隨機選取3個視野，以腎小管上皮凋亡陽性細胞占總細胞數(shù)的比率為腎小管上皮細胞凋亡率。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 將腎組織稱重，加入適量RIPA裂解液冰上研磨，4℃，離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品配成上樣緩沖液并加熱變性，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別用Bcl-2、Bax、TLR4、Myd88、NF-κB和GAPDH一抗及辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育，電化學發(fā)光(ECL)液曝光顯影，Image J軟件分析各組樣品相對表達量。

1.6ELISA檢測IL-6、IL-1β表達 根據(jù)試劑盒說明，使用大鼠特異的ELISA試劑盒測定IL-6、IL-1β在腎組織中的含量，后將涂層板置于ELISA檢測儀中讀取每個樣品在450 nm處的吸光值，計算樣品含量。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腎病理指標變化比較 與Control組相比，CIN組Scr、BUN和腎指數(shù)均顯著升高(均P<0.05)；與CIN組比較，Drug pair組Scr、BUN和腎指數(shù)均顯著降低(均P<0.05)，由此得知，制大黃-川芎藥對能夠有效防止造影劑造成的腎功能減弱。見表1。

2.2各組腎小管上皮細胞凋亡率比較 CIN組腎小管細胞凋亡率〔(32.69±5.74)%〕較Control組〔(3.41±0.03)%〕明顯增多(P<0.05)，與CIN組相比，Drug pair組腎小管細胞凋亡明顯減少〔(13.32±1.98)%，P<0.05〕。

2.3各組腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白表達比較 與Control組相比，CIN組Bcl-2表達顯著降低，Bax表達顯著升高；Drug pair組較CIN組Bcl-2表達明顯升高，Bax表達明顯降低(均P<0.05)，見圖1、表2。

2.4各組TLR4/Myd88/NF-κB信號蛋白表達比較 與Control組相比，CIN組TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；Drug pair組較CIN組TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達均明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖2、表3。

表1 各組腎病理指標變化

與Control組相比：1)P<0.05；與CIN組相比：2)P<0.05，下表同

圖1 腎組織中Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

組別Bcl-2BaxControl組0.32±0.030.11±0.01CIN組0.09±0.011)0.49±0.051)Drug pair組0.21±0.022)0.22±0.022)

圖2 各組腎組織中TLR4/Myd88/NF-κB信號通路蛋白表達檢測

組別TLR4Myd88NF-κBControl組0.88±0.091.36±0.150.83±0.09CIN組1.16±0.121)2.02±0.231)1.12±0.111)Drug pair組0.93±0.082)1.41±0.162)0.91±0.102)

2.5各組炎癥因子IL-6、IL-1β分泌水平比較 與Control組相比，CIN組IL-6、IL-1β分泌顯著增加(均P<0.05)；Drug pair組較CIN組顯著降低了炎性細胞因子IL-6、IL-1β分泌水平(均P<0.05)，見表4。

表4 各組腎組織中炎癥因子IL-6、IL-1β分泌水平水平

3 討 論

CIN是應用CIN時發(fā)生的重要并發(fā)癥，是繼腎灌注不足和腎毒性藥物之后，第三大醫(yī)院獲得性急性腎損傷原因，約占所有醫(yī)院獲得性腎衰竭的11%〔8,9〕。臨床上使用等滲和(或)低滲對比劑、加強水合作用、使尿堿化、在手術(shù)前24～48 h停止使用腎毒性藥物等措施預防CIN。對于有效預防CIN的藥物，目前研究主要集中在N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗氧化劑(抗壞血酸)、前列腺素E1、腺苷受體抑制劑(茶堿)、低劑量多巴胺、鈣拮抗劑等，但是目前尚無明確的證據(jù)支持這些藥物的治療效果和有效劑量〔6,10～12〕。龔學忠等〔4〕發(fā)現(xiàn)其能有效抑制CM誘使的腎小管上皮細胞凋亡，保護CIN大鼠腎功能。此外，以制大黃、川芎為主要藥物的經(jīng)驗方川黃方能有效治療CM導致的急性腎損傷及慢性腎臟病基礎上的急性腎損傷〔3,13〕。

CIN的病理生理學較為復雜，炎癥可能發(fā)生在最初的低氧和活性氧(ROS)介導的損傷之后，具有炎癥、血管損傷和缺氧的正反饋循環(huán)；與炎癥相關的因素包括釋放氧自由基的氧化應激反應，內(nèi)皮功能障礙或凋亡及導致腎髓質(zhì)缺血和缺氧的腎血管收縮〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，造影劑可導致腎髓質(zhì)缺血缺氧，進而導致腎臟脂質(zhì)過氧化，腎髓質(zhì)外區(qū)氧自由基的產(chǎn)生，從而引起腎小管損傷，且病理檢查顯示管腔、透明管狀物、扁平管狀上皮細胞顯著擴張，并伴有局灶性間質(zhì)炎癥〔14,15〕，提示CIN發(fā)生發(fā)展與腎臟炎癥密切相關。

TLR4是在腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、足細胞和其他腎細胞中表達〔16～19〕，TLR4可能參與了腎間質(zhì)炎癥的發(fā)生和受損腎小管的修復。TLR4在炎癥信號轉(zhuǎn)導中起重要作用，可通過調(diào)節(jié)下游信號分子如NF-κB的表達來激活免疫和炎癥反應，進而釋放大量的炎性細胞因子和效應細胞分子，最終導致腎臟炎癥〔20,21〕。TLR4與相應配體的結(jié)合觸發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導途徑，包括Myd88和Myd88獨立途徑〔22〕。TLR2和TLR4與腎缺血再灌注損傷有關，用脂多糖刺激小鼠腎小管上皮細胞可導致TLR4表達和趨化因子分子分泌增加〔23,24〕。此外，移植有TLR4缺陷型小鼠腎臟的受體正常小鼠無顯著急性腎損傷現(xiàn)象，相反，缺乏TLR4基因的受體小鼠移植了含有正常TLR4基因的小鼠腎臟后則呈現(xiàn)處嚴重的內(nèi)毒素誘導的急性腎損傷〔25〕。NF-κB可調(diào)控炎性細胞因子IL-6和IL-1β的表達〔26〕。本研究結(jié)果表明，制大黃-川芎藥對保護CIN具體機制可能與抑制TLR4表達，調(diào)節(jié)TLR4/Myd88/NF-κB信號轉(zhuǎn)導，進而降低IL-6、IL-1β等下游炎癥因子的表達來防止腎小管上皮細胞損傷有關。