龔文兵 謝純良 周映君 朱作華 王亞惠 彭源德

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

猴頭菇[Hericium erinaceus(Bull.) Pers]，是一種極為重要的食藥用菌，因外形酷似猴頭而得名。猴頭菇進(jìn)入人們的飲食由來(lái)已久，《臨海水土異物志》中稱：“民皆好啖猴頭羹，雖五肉臛不能及之?！焙镱^菇栽培起源于中國(guó)，是我國(guó)目前常規(guī)栽培的食藥用菌之一[1]。

自1994年Kawagishi等[2]從猴頭菇菌絲體中發(fā)現(xiàn)一類鳥巢烷型二萜類化合物（猴頭菌素），并報(bào)道該類化合物具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成活性以來(lái)，猴頭菇中的二萜類化合物受到了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)從猴頭菇中分離到 25種鳥巢烷型二萜類化合物[3-4]。此外，猴頭菇中還含有其他類型的活性成分，包括多糖、甾體化合物、生物堿類化合物等，具有保肝護(hù)胃、抗癌、抗氧化等多種功效[4]。多年來(lái)圍繞猴頭菇的研究報(bào)道主要集中于活性物質(zhì)的提取與鑒定[5]，而對(duì)其遺傳育種的研究嚴(yán)重滯后，導(dǎo)致新品種選育進(jìn)程緩慢，嚴(yán)重影響了猴頭菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

優(yōu)良的菌種是食藥用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，雜交育種是食藥用菌品種選育中應(yīng)用最廣泛、成效最顯著的育種方法之一[6]。猴頭菇是異宗結(jié)合擔(dān)子菌，減數(shù)分裂后產(chǎn)生有性擔(dān)孢子[7-8]?？梢岳脝捂呔昱鋵?duì)進(jìn)行猴頭菇雜交育種，獲得性狀優(yōu)良的新品種。雜交育種中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是通過(guò)單孢分離獲得單核體。與香菇等傘菌一樣，在猴頭菇中通常采用子實(shí)體懸掛法分離單孢[7,9]。其方法是將整個(gè)子實(shí)體置于無(wú)菌的孢子收集器中彈射孢子1天左右，制備孢子懸浮液，連續(xù)稀釋后接種于培養(yǎng)基，再獲得單孢菌株。由于猴頭菇子實(shí)體表面不光滑，擔(dān)孢子著生于裸露的菌刺上，采用子實(shí)體懸掛法分離單孢污染率較高，并且操作時(shí)間長(zhǎng)。本試驗(yàn)建立一種簡(jiǎn)單快速的單孢分離方法，旨在推動(dòng)猴頭菇的遺傳育種研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試菌株

供試菌株為猴頭菇雜交子HeC9，由‘常山猴頭菇’和‘猴頭911’的單核體菌株配對(duì)獲得?！Ｉ胶镱^’和‘猴頭 911’菌株由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所王波老師提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基：麥芽浸粉 30.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL。

100 mg/mL氨芐青霉素配置：稱取5 g氨芐青霉素置于50 mL 離心管中，加入40 mL無(wú)菌水，充分混勻后定容至50 mL。采用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，滅菌，分裝后置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 孢子采集

參照于海龍等[10]的方法進(jìn)行猴頭菇栽培，子實(shí)體八成熟時(shí)采收。在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精對(duì)猴頭菇子實(shí)體進(jìn)行消毒。分兩種方法收集單孢，一為子實(shí)體懸掛彈射法。選擇9個(gè)猴頭菇子實(shí)體進(jìn)行單孢分離，用滅菌的500 mL 燒杯作為孢子收集器收集單孢，孢子彈射時(shí)間為24 h。另一為菌刺洗脫法。將2 μL 100 mg/mL氨芐青霉素加入含有2 mL無(wú)菌水的離心管中，用無(wú)菌的鑷子挑取1個(gè)猴頭菇子實(shí)體上的9根菌刺，放入上述氨芐青霉素溶液中清洗數(shù)次，再將清洗后的菌刺放入含有2 mL 無(wú)菌水的離心管中搖晃數(shù)次，即制成猴頭菇孢子懸浮液（菌刺洗脫法）。每根菌刺制備1管孢子懸浮液。

2.2 單孢分離

采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行猴頭菇孢子的分離。通過(guò)連續(xù)稀釋孢子液，使孢子分散到較低濃度，再取200 μL稀釋后的猴頭菇孢子懸浮液，用玻棒均勻涂布于含有氨芐青霉素的MEA培養(yǎng)基中（20 mL培養(yǎng)基中加入20 μL 100 mg/mL氨芐青霉素），然后將培養(yǎng)皿置于恒溫箱內(nèi)，25 ℃避光培養(yǎng)。

2.3 單核菌絲鑒定

待孢子萌發(fā)至肉眼可見(jiàn)，即刻挑取單菌落，置于新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的菌落長(zhǎng)到1～2 cm時(shí)，置于顯微鏡下觀察，沒(méi)有鎖狀聯(lián)合即是由擔(dān)孢子萌發(fā)而生成的單核菌絲。

采用子實(shí)體懸掛彈射法分離單孢作為對(duì)照，選取整個(gè)猴頭菇子實(shí)體制備孢子懸浮液，再用無(wú)菌水連續(xù)稀釋進(jìn)行單孢分離[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種單孢分離方法的比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，子實(shí)體懸掛彈射法中，2個(gè)子實(shí)體在孢子收集器中感染真菌，棄用；4個(gè)子實(shí)體獲得了孢子懸浮液，經(jīng)連續(xù)稀釋后涂布于MEA培養(yǎng)基，所有的平皿全部感染細(xì)菌；僅有3個(gè)猴頭菇子實(shí)體獲得了單菌落，成功率為33.3%。在菌刺洗脫法中，隨機(jī)選擇1個(gè)猴頭菇子實(shí)體上的9根菌刺制備了9組孢子懸浮液，經(jīng)過(guò)稀釋、涂平皿后，有1組孢子懸浮液平皿感染細(xì)菌，其余8組獲得了單菌落，成功率為88.9%。

單孢分離能否成功，與操作難易程度、操作者的分離技術(shù)等相關(guān)。新鮮猴頭菇從開放的環(huán)境中采收，子實(shí)體上的雜菌較多，尤其是細(xì)菌。子實(shí)體懸掛彈射法中，雖然用75%的酒精對(duì)猴頭菇子實(shí)體進(jìn)行了消毒，但由于子實(shí)體較大，表面不光滑，菌刺較多，難以消毒徹底。而菌刺洗脫法只需對(duì)挑取的單根菌刺進(jìn)行抑菌消毒處理，消毒效果要好得多，這是菌刺洗脫法能夠顯著降低污染率的主要原因。此外，與子實(shí)體懸掛彈射法比較，菌刺洗脫法無(wú)需專門的孢子收集器，直接用無(wú)菌水將猴頭菇菌刺上的孢子洗下來(lái)，操作簡(jiǎn)單，也不用等待孢子彈射，縮短了單孢分離的時(shí)間。

3.2 稀釋濃度對(duì)挑取單菌落的影響

獲得孢子懸浮液后，采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行猴頭菇孢子的分離。菌刺洗脫法中，稀釋了3個(gè)濃度梯度（10-1、10-2、10-3）。在子實(shí)體懸掛彈射法中，稀釋了 6 個(gè)濃度梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。每種濃度孢子懸浮液涂布5個(gè)含有MEA培養(yǎng)基的平皿。涂皿結(jié)果（表 1）表明，菌刺洗脫法中，10-1濃度的孢子懸浮液所涂平皿，萌發(fā)的單菌落很密集，單個(gè)平皿中的單菌落數(shù)大于等于100個(gè)，難以挑取單菌落到新的培養(yǎng)基上。10-2濃度的孢子懸浮液，孢子萌發(fā)的單菌落數(shù)量比較適中，單個(gè)平皿的單菌落數(shù)多介于 10～50個(gè)之間，易于挑取單菌落。10-3濃度的孢子懸浮液所涂平皿單菌落偏少，單個(gè)平皿單菌落不足10個(gè)。子實(shí)體懸掛彈射法中，4個(gè)稀釋濃度（10-1、10-2、10-3、10-4）的孢子懸浮液所涂平皿上單菌落密集，難以挑取單菌落。10-5濃度的孢子懸浮液所涂平皿，孢子萌發(fā)的單菌落數(shù)量比較適中。10-6濃度的孢子懸浮液所涂的平皿上單菌落較少（表1）。這可能是由于猴頭菇單根菌刺上的孢子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其整個(gè)子實(shí)體上的孢子數(shù)量。孢子懸浮液的稀釋倍數(shù)影響后續(xù)挑取單菌落的難易程度?？梢栽谕棵笄埃℃咦討腋∫哼M(jìn)行鏡檢，視野中有3～5個(gè)孢子的懸浮液濃度較適宜。

表1 稀釋濃度與單菌落數(shù)量的關(guān)系

3.3 單核菌絲鏡檢結(jié)果

利用菌刺洗脫法，總共獲得了240個(gè)單菌落。對(duì)這些萌發(fā)的菌株進(jìn)行顯微鏡觀察鑒定，若無(wú)鎖狀聯(lián)合的可初步認(rèn)為是單孢萌發(fā)而生成的單核菌絲，有鎖狀聯(lián)合的為雙核菌絲。結(jié)果顯示，單核菌絲較雙核菌絲細(xì)，挑取的240個(gè)菌株中，222個(gè)是單核菌株（圖1），其余18個(gè)菌株是具有鎖狀聯(lián)合的雙核菌株（圖2），采用菌刺洗脫法分離獲得的單核菌株比例為92.5%。萌發(fā)的雙核菌絲可能是由于挑取的菌落中包含了可以配對(duì)的單孢。

圖1 猴頭菇單核菌絲

圖2 猴頭菇雙核菌絲

4 結(jié) 論

由于猴頭菇子實(shí)體表面布滿菌刺，而擔(dān)孢子著生于裸露的菌刺上，采用傳統(tǒng)的子實(shí)體懸掛法分離單孢成功率不高。本研究建立了一種簡(jiǎn)單易行的猴頭菇單孢分離方法，對(duì)推動(dòng)猴頭菇遺傳育種研究具有積極意義。與子實(shí)體懸掛彈射法相比，最大的不同在于本方法是利用易于消毒的猴頭菇菌刺，將菌刺上的單孢直接洗下來(lái)，非常簡(jiǎn)單、方便，不需專門的孢子收集器。在降低污染率的同時(shí)，也縮短了單孢分離的時(shí)間，是一種切實(shí)可行的單孢分離手段。除了猴頭菇，本方法還可以推廣到其他食藥用菌品種，挑取小塊著生孢子的組織進(jìn)行消毒抑菌處理，將孢子沖洗下來(lái)后再分離單孢，尤其適合子實(shí)體表面不光滑，難以進(jìn)行消毒的菇類。