孫海梅 孫婷怡 楊 姝 吳 波 季鳳清 周德山

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學與組織學胚胎學系,北京 100069)

Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC),是西班牙神經(jīng)解剖學家Santiago Ramony Cajal于1893年首次在胃腸道中發(fā)現(xiàn)的一類特殊間質(zhì)細胞,與胃腸道平滑肌和神經(jīng)纖維末梢在解剖學上有緊密聯(lián)系,具有獨立功能,既是胃腸起搏細胞,又具有傳導神經(jīng)遞質(zhì)的作用[1]。ICC廣泛存在于哺乳動物的整個消化道管壁內(nèi),按分布區(qū)域可大致分為：分布于胃、小腸和結(jié)腸內(nèi)的環(huán)肌與縱行肌之間的肌間神經(jīng)叢ICC;位于黏膜下環(huán)肌層表面的ICC;位于小腸深肌叢區(qū)域的ICC;廣泛散布于環(huán)肌和縱肌肌束內(nèi)的ICC[2]。

目前消化道全層鋪片技術由于能夠直觀、全面地顯示ICC的分布、形態(tài)以及形成的細胞網(wǎng)絡,而成為研究胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要方法之一,但文獻中卻鮮少提及此方法的詳細操作過程。已知ICC特異性表達由原癌基因c-kit編碼的受體酪氨酸激酶即c-kit蛋白控制,所以,c-kit蛋白常被用作標記ICC[3]。本研究在傳統(tǒng)全層鋪片制作技術的方法上進行摸索和改良,結(jié)合c-kit 免疫熒光染色顯示小鼠胃腸道內(nèi)不同位置ICC的形態(tài),為從事相關研究的同行提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物

選用C57BL/6J小鼠,8～10周齡,雌雄不限,由首都醫(yī)科大學動物部提供(實驗動物編號AEEI-2016-143)。

1.2 試劑

牛血清白蛋白BSA(中杉金橋生物技術有限公司);大鼠抗小鼠c-kit單克隆抗體ACK2(1∶200,eBioscience公司);Cy3標記的羊抗大鼠IgG(1∶300,Invitrogen公司)。

1.3 取材固定

小鼠取材前12h禁食。頸椎脫臼法處死小鼠,腹正中切口暴露腹腔,快速取出胃、空腸和結(jié)腸,置于放有4℃預冷0.01mol/L的PBS的平皿中,用注射器PBS反復注入胃或腸腔內(nèi)沖洗,以充分去除腔內(nèi)容物,分別待制備冷凍切片和鋪片。

1.4 冷凍切片制備

將沖洗好的胃組織剪成約0.5cm×0.5cm的組織塊,浸入放有OCT的包埋模具中,迅速投入液氮,數(shù)秒后待液氮沸騰停止,取出組織立即放入-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯雍憷湎淅鋬銮衅?切片厚度7μm,APES載玻片貼片,吹干,丙酮固定15min后進行染色。

1.5 鋪片制備

將沖洗好的胃腸道組織分別用手術線結(jié)扎胃賁門端或腸管一端,用注射器將4℃預冷的丙酮固定液注入胃或腸腔內(nèi),使其維持適當充盈狀態(tài),結(jié)扎胃幽門端或腸管另一端,置入丙酮固定液中固定24h(圖1)。制備全層鋪片前去除結(jié)扎部分,將胃沿小彎側(cè)剪開或沿腸系膜緣剪開腸管,取胃體和胃竇的中間1/3部分及腸管制作全層鋪片。于體視解剖顯微鏡下,用鐘表鑷依次剝離黏膜層、黏膜下層,再將環(huán)行平滑肌層與縱行平滑肌分離,并剪成適當大小的組織塊,置于0.01mol/L的PBS中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫熒光染色

將制備好的冷凍切片(胃)和全層鋪片(胃、小腸、結(jié)腸)用0.01mol/L 的PBS漂洗5min×3次;1%BSA室溫孵育1h,以降低非特異性染色;棄去多余孵育液,滴加0.1%BSA稀釋的一抗,放置于濕盒內(nèi)4℃過夜;次日,0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,滴加0.1%BSA稀釋的熒光標記二抗,濕盒內(nèi)室溫避光孵育1h;0.01mol/L的PBS漂洗5min×3次,染好的鋪片組織用自制鋪片轉(zhuǎn)移托轉(zhuǎn)移到載玻片上,與染好的冷凍切片均用水溶性熒光封片劑封片,于熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

紅色熒光標記的細胞為c-kit蛋白陽性的ICC(圖2),應用冷凍切片進行免疫熒光染色,不能清晰顯示胃壁內(nèi)不同部位ICC形態(tài)。為清晰顯示ICC的形態(tài)結(jié)構,繼而進行全層鋪片的免疫熒光染色(圖3～5),結(jié)果表明,網(wǎng)狀分布于胃(圖3A)、空腸(圖3B)和結(jié)腸(圖3C)的肌間神經(jīng)叢ICC,其胞體呈梭形或星形,細胞核呈圓形,有2～4個細長突起,突起反復分支,彼此間相互連接形成致密復雜的細胞網(wǎng)絡;廣泛散布于胃(圖4A)和結(jié)腸(圖4B)的環(huán)縱肌束內(nèi)ICC,其胞體呈梭形,細胞核橢圓,有2個細長的突起,走行與細胞軸長軸一致;位于空腸深肌叢區(qū)域的ICC(圖5A)數(shù)量較少,所形成的細胞網(wǎng)絡較稀疏;位于結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層表面的ICC(圖5B),其胞體形態(tài)不規(guī)則,胞體較大,多個細長突起交織成獨立的細胞網(wǎng)絡。

圖1 丙酮充盈的小鼠胃(A)和小腸(B).

圖2 冷凍切片顯示小鼠胃壁內(nèi)ICC,標尺=100μm.

圖3 全層鋪片顯示小鼠胃(A)、空腸(B)、結(jié)腸(C)肌間神經(jīng)叢ICC,標尺=100μm.

圖4 全層鋪片顯示小鼠胃(A)、結(jié)腸(B)環(huán)縱肌束內(nèi)ICC,標尺=100μm.

圖5 全層鋪片顯示小鼠空腸深肌叢ICC(A)、結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層表面ICC(B),標尺=100μm.

3 討論

切片技術是形態(tài)學研究的傳統(tǒng)、經(jīng)典實驗技術,但存在一定的局限性,很難客觀反映某些器官、組織或細胞的全貌。比如分布于消化管道的腸神經(jīng)系統(tǒng),因其網(wǎng)狀結(jié)構的特殊性,難以應用普通切片從某一斷面觀察神經(jīng)細胞[4]。全層鋪片技術早期一般應用于虹膜、腸系膜、小血管等較薄的膜狀組織的制片,而對于較厚的組織少有應用。本實驗將消化道全層鋪片技術用于顯示胃腸道不同部位ICC,染色結(jié)果證實該方法較切片具有明顯優(yōu)勢,能夠直接暴露肌內(nèi)、肌間ICC,從而完整觀察其形態(tài)和分布,并能直觀顯示ICC的細胞密度和所形成的細胞網(wǎng)絡。

以往文獻雖然對多種實驗動物的ICC顯示方法進行過研究,但缺乏對鋪片制作過程及注意事項的詳細介紹,同時鮮見對小鼠消化道不同部位ICC鋪片染色對比觀察的研究。本實驗在不斷改進鋪片制作技術的過程中,總結(jié)了如下鋪片技術的關鍵要點：(1) 由于組織的結(jié)構特點,取材時不同器官或同一器官不同部位對于制作好的鋪片標本有一定影響,如與胃竇相比,胃底和胃體更易鋪片,靠近胃大彎側(cè)要比胃小彎側(cè)容易鋪片,小腸近回盲部的位置最易鋪片;(2) 取材時需要對胃腸道進行充分地充盈固定,有助于腔壁的肌層變薄,易于染色,且成片后效果較好;(3) 制作鋪片標本是在解剖顯微鏡下的精細操作,所以選擇尖細的進口鐘表鑷有助于精準地分離組織。

本研究通過應用全層鋪片技術,結(jié)合免疫熒光染色,并運用熒光顯微鏡進行觀察,能夠清晰、全面的顯示胃腸道各部位ICC的形態(tài)和密度,精確度較高,可以為實驗結(jié)果的準確性打下良好基礎,并對深入研究ICC與胃腸運動以及相關疾病的關系具有重要意義。