郭 楠 許 波

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種復(fù)雜的生殖內(nèi)分泌及代謝性疾病，育齡婦女的發(fā)病率約為10%，占無排卵性不育患者的30%～75%，以持續(xù)性月經(jīng)異常、雄激素分泌過多以及卵巢多囊性改變?yōu)樘卣?，主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕、多毛和/或痤瘡，主要助孕措施包括生活方式調(diào)整、藥物干預(yù)、腔鏡手術(shù)以及輔助生殖技術(shù)[1-2]。PCOS合并不孕癥患者在行體外受精-胚胎移植周期時，其胚胎質(zhì)量、臨床妊娠率等多個指標(biāo)均低于輸卵管性因素(輸卵管梗阻、粘連等)導(dǎo)致不孕的患者[3-5]。進(jìn)一步研究[4-5]認(rèn)為，PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是造成PCOS患者臨床結(jié)局(包括優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等)較差的主要原因之一。但目前尚缺乏關(guān)于卵母細(xì)胞質(zhì)量下降原因的研究。因此，本研究對PCOS患者的卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析以及檢測線粒體DNA(mitochondria DNA, mtDNA)拷貝數(shù)，探討PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2017年1～12月接受卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的115例不孕患者作為研究對象，年齡25～33歲，男方均為重度少弱精癥或梗阻性無精癥患者，男女雙方染色體檢查正常，均無糖尿病家族史。按女方是否伴PCOS分為試驗組(PCOS組，n=57)和對照組(非PCOS組，n=58)。試驗組均符合鹿特丹PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]：①不排卵或偶發(fā)排卵；② 雄激素水平升高(>1.0 nmol/mL)，并排除其他因素(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素腫瘤等)；③超聲顯示卵巢增大，單側(cè)直徑2～9 mm的卵泡≥12枚，或單側(cè)卵巢體積>10 mL。對照組:①平素月經(jīng)規(guī)律；② 超聲檢查無多囊卵巢改變；③ 基礎(chǔ)生殖內(nèi)分泌無異常，且無全身及其他婦科、內(nèi)分泌等疾病。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞獲取 所有研究對象采用標(biāo)準(zhǔn)長方案[3]控制性促排卵，即從前一月經(jīng)周期的黃體中期開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，14天后行卵泡刺激素、促黃體生成素、雌激素水平檢測和陰道超聲檢查，適時加用促性腺激素(國藥準(zhǔn)字H20052130，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，藥品規(guī)格：以尿促卵泡素效價計75 IU)150～300 IU，當(dāng)至少有2枚卵泡直徑≥18 mm或至少3枚卵泡直徑≥17 mm時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(注冊證號：S20110045；生產(chǎn)單位：Merck Serono Europe Limited；藥品規(guī)格：250 μg)250 μg，36～38 h行超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。

收集廢棄卵母細(xì)胞(常規(guī)ICSI 42～48 h后未分裂的成熟受精卵母細(xì)胞)共187 枚，其中試驗組52枚用于超微結(jié)構(gòu)觀察，另38枚用于mtDNA拷貝數(shù)檢測；對照組57枚和40枚分別用于超微結(jié)構(gòu)觀察和mtDNA拷貝數(shù)檢測。

1.2.2 卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將卵母細(xì)胞樣本置戊二醛(25 g/L)4℃固定6 h，1×硝酸緩沖鹽溶液洗滌；常溫下1%鋨酸固定1.5 h，之后乙醇梯度脫水。樣本完成脫水后，環(huán)氧丙烷透明30 min，置環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂(1∶1)混合液中浸透至少1.5 h，環(huán)氧樹脂包埋，65℃烤箱中固化4 h。以60～80 nm厚度對包埋組織進(jìn)行切片，后醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，制備好的電鏡樣品JEM- 1230 型透射電鏡下觀察。

1.2.3 卵母細(xì)胞線粒體數(shù)量統(tǒng)計與mtDNA拷貝數(shù)檢測 卵母細(xì)胞電鏡切片中，具有圓滑的橢圓形或者紡錘形，線粒體內(nèi)的橫嵴清晰，結(jié)構(gòu)完整的線粒體標(biāo)記為正常線粒體并計數(shù)；而整體輪廓不清晰，內(nèi)含空泡，缺少明確的嵴結(jié)構(gòu)標(biāo)記為異常線粒體并計數(shù)。同時，對每張切片的卵母細(xì)胞面積進(jìn)行計算。每個卵母細(xì)胞至少統(tǒng)計隨機選取的3張電鏡切片，之后統(tǒng)計每個卵母細(xì)胞單位面積內(nèi)的線粒體數(shù)量，計算正常/異常線粒體比例。

卵母細(xì)胞經(jīng)NaH2PO4(pH 2.0)去除透明帶后入液氮保存。采用熒光實時定量PCR法檢測卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)，SYBR premix ExTaqTMII試劑盒購自日本TaKaRa公司。反應(yīng)體系：5 μL SYBR+0.4 μL引物+3μL模板，補水至10 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)條件：95℃變性10 s，95℃變性5 s后61℃退火31 s，共40個循環(huán)。PCR操作在ABI 7500 實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosysterms公司)完成，內(nèi)標(biāo)曲線由10倍稀釋液生成，標(biāo)準(zhǔn)品為1 ng PCR產(chǎn)物中含有158 bp的5.8×109雙鏈DNA分子，每次反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過標(biāo)準(zhǔn)品確定，每個樣品的起始 mtDNA 拷貝數(shù)通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)分析的引物序列為,ND1-F :5’-GGCTACATACAATTACGCAAAG-3’,R :5’-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG -3’。

1.3 觀察指標(biāo) 入院后收集患者的一般資料，包括年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。并于月經(jīng)第2～3天清晨空腹采血檢測生化指標(biāo)。卵母細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量及mtDNA拷貝數(shù)的熒光實時定量PCR檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者年齡、基礎(chǔ)雌激素、基礎(chǔ)卵泡刺激素、基礎(chǔ)催乳素水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，試驗組體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)雄激素、基礎(chǔ)促黃體生成素、血糖及胰島素水平均高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

2.2 兩組卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)比較 兩組卵母細(xì)胞的透明帶結(jié)構(gòu)基本一致，均為網(wǎng)狀的疏松結(jié)構(gòu)，含有顆粒細(xì)胞碎片殘留和少量纖維物。透明帶與卵母細(xì)胞膜間存在卵周隙，卵周隙均可見樹突狀的微絨毛，胞膜近卵周隙的位置可見大量皮質(zhì)顆粒，詳見圖1。兩組高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞的形態(tài)和分布均未見異常。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

對照組卵母細(xì)胞線粒體分布均勻，功能和形態(tài)正常的線粒體呈現(xiàn)較為圓滑的橢圓形或紡錘形，線粒體內(nèi)的弧形或橫嵴較為清晰，結(jié)構(gòu)完整。試驗組大量的線粒體結(jié)構(gòu)不清晰，缺少明確的嵴結(jié)構(gòu)，且整體輪廓不清楚，內(nèi)含空泡。試驗組中異常線粒體比例58.7%高于對照組17.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.260,P=0.037)，詳見圖2。同時，試驗組卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量(44.3±9.6)個/切片低于對照組(65.4±12.7)個/切片，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.670，P=0.042)，詳見圖3。

圖1 卵母細(xì)胞透明帶和細(xì)胞膜周邊超微結(jié)構(gòu)

注：ZP為透明帶，PVS為卵周隙；黑色箭頭為皮質(zhì)顆粒，白色箭頭為微絨毛；標(biāo)尺為500 nm

圖2 卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)比較

注：黑色箭頭為正常線粒體；白色箭頭為異常線粒體

圖3 卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量比較

注：圓圈內(nèi)表示單位面積內(nèi)線粒體數(shù)量

2.3 卵母細(xì)胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)檢測 利用熒光實時定量PCR檢測兩組卵母細(xì)胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)。結(jié)果，試驗組卵母細(xì)胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)(54 390±19 139)個低于對照組(88 135±44 235)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.321，P=0.027)。

3 討論

PCOS是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌疾病。PCOS患者的內(nèi)分泌環(huán)境復(fù)雜，特征表現(xiàn)為卵泡期基礎(chǔ)黃體生成素水平升高，并常伴有高雄激素血癥、高胰島素血癥以及肥胖等多種內(nèi)分泌及代謝異常[2]。本次研究提示,PCOS組患者體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)雄激素、黃體生成素、血糖、胰島素水平較正常對照組均有顯著升高，與上述研究結(jié)果一致。同時有研究[3-5]證實，PCOS患者的ART臨床結(jié)局較差，表現(xiàn)為受精率和種植率下降，其主要原因與卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和胚胎發(fā)育潛能降低有關(guān)[5,7]，并發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液內(nèi)的一些對卵母細(xì)胞質(zhì)量及發(fā)育潛能起負(fù)面影響的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α、粒細(xì)胞集落刺激因子等出現(xiàn)異常表達(dá)[8-9]。盡管這些研究都認(rèn)為PCOS患者卵母細(xì)胞質(zhì)量會下調(diào)，但是其結(jié)論主要來源于臨床結(jié)局的推論或生化指標(biāo)變化的推測，而病理機制尚不完全清楚。

線粒體是卵母細(xì)胞中數(shù)量最多，也是最重要的細(xì)胞器，參與卵母細(xì)胞的基本生理活動如生發(fā)泡破裂、紡錘體形成、染色體分離等[6,11]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變將直接影響卵母細(xì)胞的代謝、增殖和分化[11-12]。有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體明顯多于未成熟卵母細(xì)胞，且卵母細(xì)胞發(fā)育能力與線粒體數(shù)量呈正相關(guān)；高齡女性的卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)明顯低于年輕女性，且隨年齡增長，線粒體內(nèi)mtDNA的突變率明顯增高，線粒體膜電位與ATP水平逐漸降低。直接觀察卵母細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)是評估卵母細(xì)胞質(zhì)量最直接和客觀的方法[10]。本研究聯(lián)合透射電鏡和熒光實時定量PCR技術(shù)對PCOS患者卵母細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵細(xì)胞器線粒體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PCOS患者卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯下降，且出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)異常如缺少嵴結(jié)構(gòu)，內(nèi)含空泡，輪廓不清等，上述改變可能會導(dǎo)致卵母細(xì)胞能量代謝和氧化應(yīng)激異常，最終影響卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量。

綜上所述，PCOS患者卵母細(xì)胞內(nèi)異常線粒體比例升高和mtDNA拷貝數(shù)下降，可能會導(dǎo)致PCOS患者的卵母細(xì)胞中線粒體參與的能量代謝、氧化應(yīng)激等關(guān)鍵過程受損，并最終反映為卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的降低。