(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海 200093)

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，在臨床治療和科學研究中應(yīng)用廣泛。為了減少凍融過程對細胞造成的損傷和致死，低溫保護劑的組分及添加步驟至關(guān)重要[1]。1959年，J. E. Lovelock等[2]創(chuàng)新性地以體積分數(shù)為10%二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑，同時加入體積分數(shù)為5%～90%的血清作為冷凍儲存液來保存細胞。至今這兩種物質(zhì)仍然作為主要成分出現(xiàn)在保護劑配方中。DMSO能減少細胞脫水和胞內(nèi)冰的形成，維持細胞膜的完整性[3]，但高體積分數(shù)的DMSO會對細胞造成嚴重的毒性損傷。胎牛血清(FBS)常作為細胞低溫保存的血清，其保護機制是通過改變滲透壓，在冷凍時促使細胞脫水，解凍時抑制水分快速滲入并脫出胞內(nèi)的保護劑，促進溶液玻璃化形成，保護細胞膜和細胞的完整性[4]。但FBS具有攜帶病毒、感染疾病的風險，如異種動物傳染病、瘋牛病等，且價格昂貴，批次之間穩(wěn)定性差[5]。

蠶絲是一種天然的高分子材料，無污染且來源豐富，主要由絲膠蛋白和絲素蛋白組成。近年來，絲膠蛋白被應(yīng)用于細胞的低溫保存領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)其具有替代FBS作為冷凍介質(zhì)的作用。據(jù)文獻報道，基于絲膠蛋白的無血清保護劑相繼成功凍存了倉鼠骨髓瘤細胞、雜交瘤細胞、卵巢細胞[6]，小鼠的雜交瘤細胞、大鼠胰島瘤細胞[7-9]，人的肝細胞[10]，大鼠胰島細胞[11]及牛精子和胚胎[12-13]。絲素蛋白被廣泛地應(yīng)用于藥物釋緩、骨組織修復(fù)、人工皮膚、血管等生物醫(yī)用材料的制備，以及降血糖、抑菌等醫(yī)療保健方面[14-15]。但將絲素蛋白加入低溫保護劑中，探討其是否具有低溫保護作用的潛力，目前還未有相關(guān)的公開報道。

以梅山豬耳成纖維細胞作為實驗材料，具有取材方便、效率高等優(yōu)點，并且體細胞和生殖細胞同樣具有全能型，可以作為動物活體保種的有利輔助方式[16-17]。本文將蠶絲蛋白加入低溫保護劑中，用于梅山豬耳成纖維細胞的低溫保存。用絲膠蛋白替代FBS，避免因血清帶來的污染及病毒感染的風險，并在保護劑中添加絲素蛋白來降低DMSO的體積分數(shù)，減少對細胞的損傷。以期研發(fā)一種基于天然蠶絲蛋白的新型、低毒性的無血清低溫保護劑，并應(yīng)用于其他細胞、組織的低溫保存實踐中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：蠶繭(廣西平果桑移天下絲綢有限公司)，梅山豬耳成纖維細胞(上海市農(nóng)業(yè)科學院)。

試劑：絲膠蛋白(日本和光純藥)，HyClone胎牛血清(FBS)(上海博升生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司)。

1.2 設(shè)備與耗材

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限司)，超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，酶標儀(英國柏楉有限公司)，程序降溫盒(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司)，透析袋(美國Rebus公司)。

1.3 方法

1.3.1絲素蛋白的制備

參考文獻[18]的制備方法，將蠶繭除雜處理后，在質(zhì)量濃度為0.2%的碳酸鈉溶液中進行脫膠處理30 min；得到的絲素纖維沖洗烘干后，60 ℃條件下用9.3 mol/L溴化鋰溶解4 h；將絲素蛋白溶液進行透析、離心、濃縮等處理，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2細胞培養(yǎng)

將豬耳成纖維細胞接種于含體積分數(shù)為20%FBS、1%丙酮酸鈉、1%雙抗、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞生長至匯合，進行傳代/凍存等操作。

1.3.3低溫保護劑的配制

絲膠蛋白實驗：基礎(chǔ)凍存液為添加體積分數(shù)為10%DMSO的DMEM。對照組1和2分別為添加和不添加體積分數(shù)為20%FBS的低溫保護劑，實驗組3～7分別添加了質(zhì)量濃度為10%、5%、2%、1%、0.5%的絲膠蛋白來替代體積分數(shù)為20%FBS，配制基于絲膠蛋白的新型無血清低溫保護劑。

絲素蛋白實驗：基礎(chǔ)凍存液為添加體積分數(shù)為20%FBS的DMEM。對照組1為添加體積分數(shù)為10%DMSO的低溫保護劑，實驗組2～19將體積分數(shù)為10%、8%、4%、2%、1%及不添加絲素蛋白和體積分數(shù)為10%、5%、2.5%及不添加DMSO進行組合，配制基于絲素蛋白的新型低毒性低溫保護劑。

篩選出絲膠蛋白和絲素蛋白的最優(yōu)濃度后，選擇最優(yōu)濃度進行聯(lián)用，配制基于天然蠶絲蛋白的新型、低毒性的無血清低溫保護劑。

1.3.4細胞凍存

將消化后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心去上清。每組加入1 mL配制好的低溫保護劑，輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至2 mL凍存管。將標記好的凍存管放入程序降溫盒中，置于-80 ℃深低溫冰箱中凍存一周。

1.3.5細胞復(fù)蘇

從冰箱中取出凍存管，在37 ℃水浴鍋中快速搖晃凍存管，直至管內(nèi)細胞懸液完全融化。室溫下5 min內(nèi)用25 ℃含血清培養(yǎng)基稀釋。離心去掉上清液，再加入1 mL培養(yǎng)液重懸細胞。

1.3.6細胞活力檢測

臺盼藍染色法[19]：取10 μL體積分數(shù)為0.4%臺酚藍溶液和10 μL復(fù)水后的細胞懸浮液，混合均勻并靜置1 min后，滴加在細胞計數(shù)板上，按式(1)進行計數(shù)：

(1)

MTT法[19]：取復(fù)溫后的細胞懸液置于96孔板中，每種低溫保護劑設(shè)置3個平行樣，另加一組新鮮細胞作為對照組，一組細胞培養(yǎng)基作為空白組。每孔加入100 μL實驗樣本，再每孔加入20 μL MTT溶液，低速震蕩融合后置于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。4 h后吸除上層溶液，每孔加入150 μL DMSO，再低速震蕩10 min。待結(jié)晶物充分溶解后，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光值，按式(2)進行計算：

(2)

24 h貼壁率：復(fù)溫后的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集上層培養(yǎng)液，并用D-Hanks沖洗兩遍后，收集所有上清液，計數(shù)未貼壁細胞。貼壁細胞用胰酶消化后離心，取上清液，加1 mL培養(yǎng)基重懸，計數(shù)貼壁細胞。同時觀察細胞的生長情況和形態(tài)變化。按式(3)計算細胞的貼壁率：

(3)

1.4 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)都來自于至少3組平行獨立實驗，均采用平均值±標準差的形式，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計及顯著性分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 絲膠蛋白凍存細胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

將基于絲膠蛋白的無血清低溫保護劑應(yīng)用于豬耳細胞的凍存實驗，所得的細胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率如表1所示。

表1 基于絲膠蛋白低溫保護劑的細胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率Tab.1 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of sericin protein

注：用Duncan′s multiple range test法進行多重比較，同列標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。v/v為體積分數(shù)；w/v為質(zhì)量濃度。下表相同。

由表1可知，對照組1和對照組2的細胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率相比存在顯著差異(P<0.05)，說明添加體積分數(shù)為20%FBS后能顯著提高細胞的存活率和貼壁率，添加FBS對細胞的低溫保存具有一定的作用。去除FBS后，分別添加質(zhì)量濃度為10%、5%、2%、1%、0.5%的絲膠蛋白，可以看出添加質(zhì)量濃度1%絲膠蛋白的細胞存活率及24 h貼壁率最好，且顯著高于對照組1(P<0.05)。絲膠蛋白質(zhì)量濃度從10%降至1%，細胞的存活率和24 h貼壁率雖沒有嚴格按照線性變化，但呈現(xiàn)增長的趨勢。質(zhì)量濃度繼續(xù)降為0.5%時，凍存效果開始下降。說明添加質(zhì)量濃度為1%絲膠蛋白能有效替代FBS，更好地凍存細胞。

2.2 絲素蛋白凍存細胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

將基于絲素蛋白的低溫保護劑進行細胞凍存實驗，分析細胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率來驗證細胞凍存效果。實驗結(jié)果如表2所示。

實驗組1為對照組，添加體積分數(shù)為10%DMSO細胞的存活率和24 h貼壁率都較高，說明DMSO對細胞凍存具有顯著的保護作用。不添加絲素蛋白的情況下，DMSO體積分數(shù)從5%降至0，細胞的存活率和24 h貼壁率分別從73.37%、78.55%降至11.88%、6.86%，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，且有顯著性差異(P<0.05)。說明DMSO體積分數(shù)的下降對細胞存活率和24 h貼壁率具有顯著影響。降低DMSO體積分數(shù)且添加絲素蛋白后，隨著其體積分數(shù)的不斷增加，凍存效果也顯著增強。當DMSO體積分數(shù)為5%時，分別添加體積分數(shù)為1%、2%、4%、8%、10%的絲素蛋白，細胞存活率和24 h貼壁率分別從68.95%、69.19%增長至89.35%、88.94%，具有顯著性差異(P<0.05)。其中5% (v/v) DMSO+ 10% (v/v) 絲素蛋白組與對照組相比，細胞的存活率和24 h貼壁率均高于對照組，說明添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白能有效補償體積分數(shù)為5%DMSO的作用效果。但是當DMSO體積分數(shù)為0時，即使添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白，細胞的存活率和24 h貼壁率均較低，說明絲素蛋白并不能完全替代DMSO。

表2 基于絲素蛋白低溫保護劑的細胞存活率、MTT存活率及24 h貼壁率Tab.2 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of fibroin protein

注：基礎(chǔ)液為添加體積分數(shù)為20%FBS的DMEM。

圖1所示為基于絲素蛋白低溫保護劑對細胞的凍存存活率影響，將保護劑1、2、3、4、17、18、19七組數(shù)據(jù)進行對比。分析保護劑1、2、3可知，DMSO體積分數(shù)從10%降至2.5%，細胞存活率雖呈下降趨勢，但影響并不顯著，說明體積分數(shù)為2.5%DMSO就能保障較好的凍存效果。在保護劑2和3的基礎(chǔ)上添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白即保護劑17和18，細胞存活率分別從73.37%提高至89.35%、68.47%提高至78.47%，與對照組1相比無顯著差異(P>0.05)。說明DMSO體積分數(shù)高于2.5%時，DMSO起主要保護作用，但添加絲素蛋白后效果更顯著。分析保護劑4和19可得，當DMSO體積分數(shù)為0時，添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白后，細胞的存活率從11.88%提高至43.07%，說明無DMSO作用時，絲素蛋白對凍存的保護作用顯著。體積分數(shù)為5%DMSO添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白的細胞存活率與對照組相比無顯著差異，說明體積分數(shù)為10%絲素蛋白能部分替代DMSO的作用效果，將原有10%DMSO體積分數(shù)降至5%。但對比保護劑1、4和19，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白并不能完全取代DMSO，單獨作用時效果不如DMSO。

圖1 基于絲素蛋白低溫保護劑對細胞的凍存存活率影響Fig.1 Effect of fibroin protein on cell cryopreservation

2.3 蠶絲蛋白凍存細胞的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率

結(jié)合2.1及2.2的實驗結(jié)果可知，絲膠蛋白的最適質(zhì)量濃度和絲素蛋白的最適體積分數(shù)分別為1%和10%。將絲膠蛋白與絲素蛋白進行聯(lián)用，制備基于天然蠶絲蛋白高效、低毒性的無血清低溫保護劑(DMEM+5% (v/v) DMSO+1% (w/v) 絲膠蛋白+10% (v/v) 絲素蛋白)。將該低溫保護劑用于細胞凍存實驗，從細胞的存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率進行分析，探究其凍存效果。結(jié)果如表3所示。

表3 基于蠶絲蛋白低溫保護劑的細胞存活率、MTT存活率以及24 h貼壁率Tab.3 The survival rate, MTT assay and 24 h adherent rate with various concentration of silk protien

由表3可知，基于蠶絲蛋白的復(fù)合保護劑與對照組1相比，細胞存活率與MTT存活率較低，24 h貼壁率無明顯差異；與對照組2相比，細胞存活率與MTT存活率無顯著差異，24 h貼壁率較高。說明將質(zhì)量濃度為1%絲膠蛋白與體積分數(shù)為10%絲素蛋白聯(lián)用后，能達到較好的凍存效果。該新型低溫保護劑，用天然生物材料蠶絲蛋白既替代了FBS又降低了DMSO的體積分數(shù)，同時保障了較高的細胞存活率和24 h貼壁率。

3 討論

血清富含生長因子、激素、氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)，含體積分數(shù)為20%FBS的培養(yǎng)基普遍應(yīng)用于哺乳動物細胞的培養(yǎng)中[20]。FBS大多依靠進口，價格昂貴，還具有攜帶病毒、感染疾病的風險。絲膠蛋白是一種球狀蛋白，由18種氨基酸組成，具有良好的親水性和生物相容性，與FBS相比天然安全、來源豐富、價格低廉，并且絲膠蛋白經(jīng)高壓蒸氣滅菌和過濾除菌后作用效果不變[21]，適用于細胞的無菌培養(yǎng)。據(jù)報道[6-13]，絲膠蛋白替代FBS制備的新型無血清低溫保護劑，已經(jīng)成功凍存多種哺乳動物細胞。說明在細胞的凍存中，絲膠蛋白能有效替代FBS，并維持更高的細胞活性，這與本文實驗得出的結(jié)論一致。但目前還未見珍稀和優(yōu)良物種體細胞凍存研究的相關(guān)報道，本實驗為研究其他物種體細胞的低溫保存提供了一定的參考。S. Terada等[22]發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量濃度為0.25%～0.5%絲膠蛋白的抗凍劑能有效減少脂質(zhì)過氧化的有害影響，防止氧化應(yīng)激，使解凍后精液質(zhì)量顯著提高，同時發(fā)現(xiàn)當絲膠蛋白質(zhì)量濃度高于1%時，則不利于抑制脂質(zhì)的過氧化，高濃度的滲透壓也影響精液的質(zhì)量。本實驗中，絲膠蛋白質(zhì)量濃度從1%提高至10%，細胞的存活率和24 h貼壁率呈下降趨勢，這與文獻[22]的結(jié)論一致。但絲膠蛋白質(zhì)量濃度低于1%時，凍存效果顯著下降。這可能與細胞的種類有關(guān)，對于豬耳成纖維細胞，絲膠蛋白濃度過高會抑制細胞表面分子進入胞內(nèi)，引起滲透性胞內(nèi)脫水，而濃度過低則起不到足夠的保護作用。因此，針對不同的細胞類型需要篩選絲膠蛋白的最適質(zhì)量濃度。

DMSO是目前使用最廣泛的低溫保護劑，且體積分數(shù)為10%DMSO被認為是最適合細胞凍存的體積分數(shù)[23-24]。但DMSO的毒性隨著劑量的增加和溫度的升高而升高，細胞凍存效果明顯下降。有研究者通過添加糖類[25-26]或氨基酸類[27]物質(zhì)來減弱DMSO的體積分數(shù)，并取得了一定成果。本文創(chuàng)新性的將絲素蛋白用于細胞的低溫保存中，以期達到削弱DMSO體積分數(shù)或替代DMSO的作用。絲素蛋白含有豐富的氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸含量約占87%。絲素蛋白具有兩性荷電的特殊性能，天然無毒，良好的人體親和性和生物相容性等優(yōu)良性能。雖然目前對于絲素蛋白能作為低溫保護劑的作用機制尚不明確，但從絲素蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白通過酸、堿或酶徹底水解后形成絲素肽。絲素肽能與水分子之間形成較強的氫鍵作用，這些氫鍵的存在會減弱冰晶形成所需的相變驅(qū)動力，未凍結(jié)水分含量降低，從而對細胞起到保護作用[28-30]。本實驗得出體積分數(shù)為10%絲素蛋白能有效補償體積分數(shù)為5%DMSO 的作用效果，但并不能完全替代DMSO，僅添加體積分數(shù)為10%絲素蛋白的作用還不明顯。隨著絲素蛋白體積分數(shù)的提高，細胞的存活率和貼壁率均有顯著提高，說明高濃度的絲素蛋白作用更顯著。但目前由于絲素蛋白制備工藝的限制，最高體積分數(shù)只能達到10%。因此，在絲素蛋白的制備和濃度上還有一定的改進空間。

4 總結(jié)與展望

本文以梅山豬耳成纖維細胞為研究對象，探究蠶絲蛋白對細胞低溫保存的效果。制備的復(fù)合型低溫保護劑1% (w/v) 絲膠蛋白+10% (v/v) 絲素蛋白+ 5% (v/v) DMSO用于凍存豬耳成纖維細胞，實驗結(jié)果所得的存活率、MTT存活率及24 h貼壁率分別為82.60%、83.02%、88.03%。該新型低溫保護劑不僅替代了FBS，部分降低了DMSO的體積分數(shù)，還能保證較好的凍存效果。本文建立的基于天然蠶絲蛋白的低毒性、無血清低溫保護劑為其他哺乳動物體細胞低溫保存提供了一定的參考，但對于不同的細胞，絲膠蛋白和絲素蛋白的最優(yōu)濃度和配比，能否完全替代FBS或降低DMSO體積分數(shù)還需要進一步研究，并且結(jié)合不同的降溫和解凍方法，以提高細胞凍融后的存活率。