胡會(huì)剛，趙巧麗，龐振才

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524091）

菠蘿（Ananas comosus），又名鳳梨、黃梨，是一種多年生草本植物，系熱帶四大名果之一[1]，多汁，香甜，含有豐富的有機(jī)酸及維生素，具有生津止渴，清熱解毒，消食利尿，補(bǔ)益脾胃，潤腸通便等功效[2]。17世紀(jì)在我國引種成功后，種植面積和產(chǎn)量逐年擴(kuò)大，2011年，我國菠蘿生產(chǎn)總面積達(dá)5.6萬公頃，總產(chǎn)量約119萬噸[4]，現(xiàn)已成為世界十大菠蘿主產(chǎn)國之一[3]。在菠蘿生產(chǎn)加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量皮渣，占果實(shí)的15%～20%，大部分被直接丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，還加重了環(huán)境污染。研究表明，多糖是菠蘿皮渣中一類具有特殊生物活性的物質(zhì)，具有抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖[5]，提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和抗病能力[6]，抗脂質(zhì)過氧化[7]，抗氧化[8]和抗腫瘤[9]等作用，目前已鑒定出來的成分有木糖、阿拉伯糖等。菠蘿皮渣多糖經(jīng)初提后常含大量雜質(zhì)，主要包括游離蛋白質(zhì)和色素等，不但影響多糖的純度和生物活性，而且給后期的色譜分析和結(jié)構(gòu)表征帶來很大困難[10]。因此，尋求一種除蛋白效果好、脫色率高、多糖損失少、對生物活性破壞小的菠蘿皮渣多糖脫蛋白和脫色工藝尤為重要。關(guān)于菠蘿皮渣多糖體外抗氧化活性的研究已有一些報(bào)道。羅建平等[11]發(fā)現(xiàn)，菠蘿皮渣多糖對O2-·和ABTS+自由基的清除率表現(xiàn)為顯著的量效關(guān)系，清除O2-·和ABTS+自由基的半抑制率（IC50）分別為1.76 mg/mL和2.49 mg/mL。王標(biāo)詩等[12]發(fā)現(xiàn)在濃度范圍（1.50 mg/mL～3.50 mg/mL）內(nèi)，菠蘿皮渣多糖對·OH、DPPH·均有良好的清除能力，對Fe3+的還原能力隨多糖濃度的增加呈良好的量效關(guān)系。但目前針對脫蛋白脫色后菠蘿皮渣多糖的抗氧化活性研究鮮見報(bào)道。

基于此，本研究以脫蛋白率、脫色率和多糖保留率為評價(jià)指標(biāo)，對不同脫蛋白方法的作用效果進(jìn)行了對比，并確定了活性炭法脫色的最佳工藝條件，進(jìn)一步對所得精多糖體外清除自由基能力進(jìn)行評價(jià)，考察其作為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景，以期為菠蘿皮渣精多糖在化妝品和醫(yī)藥制品方面的綜合利用與開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿皮渣：購自雷州市英利鎮(zhèn)紅土地菠蘿皮綜合利用廠；粉末活性炭：廣東韓研活性炭制造有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：美國 Sigma公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）：Solarbio公司；葡萄糖：天津市福晨化學(xué)試劑廠；X-5大孔吸附樹脂：鄭州華溢科技新材料股份有限公司；聚酰胺：江蘇長豐化工有限公司；濃硫酸：廉江市愛廉化試劑有限公司；無水乙醇、正丁醇、雙氧水、氯仿、丙酮、苯酚、三氯乙酸、鹽酸，均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；FD-1C-50型真空冷凍干燥機(jī)：上海喬躍電子有限公司；RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫公司；DHG 9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)：北京佳源興業(yè)科技有限公司；MAXQ800型恒溫?fù)u床：美國Thermo公司；EL 104電子天平：梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司；79-1型磁力攪拌器：新康醫(yī)療器械有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英峪高科儀器；HH-4恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿皮渣粗多糖的制備

將新鮮、成熟的菠蘿皮渣烘干后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。取一定量的菠蘿皮渣干粉，以1∶5 g/mL料液比加入80%無水乙醇，室溫?cái)嚢杞? h，抽濾棄去上清液，殘?jiān)?0℃烘干。以1∶30 g/mL料液比向脫脂物料中加入蒸餾水，于80℃超聲波清洗儀中，以160 W的功率浸提90 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取1次。合并上清液，真空減壓濃縮至原體積1/10，加入濃縮液4倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜。離心（4 000 r/min，10 min），沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次，冷凍干燥即得菠蘿皮渣粗多糖。

1.3.2 菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白

1.3.2.1 鹽析法[13]

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液（5 mg/mL），置于小燒杯中，于磁力攪拌器上邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至設(shè)定的飽和度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，50℃攪拌30 min，冷卻至室溫后離心（4 000 r/min，20 min）去沉淀，收集上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.2 三氯乙酸法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，置于小燒杯中，加入20%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）至其終濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，30℃振蕩30 min，后將其轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中靜置12 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.3 Sevag法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，設(shè)置1～7次脫蛋白處理。每份多糖溶液中加入其體積1/4的Sevag試劑[氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1（體積比）]，混合振蕩 60 min（轉(zhuǎn)速180 r/min），4 000 r/min離心10 min，棄去下層有機(jī)相和中間層膠狀變性蛋白質(zhì)，取上層溶液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.4 TCA-正丁醇法[14]

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，加入2倍體積TCA-正丁醇混合溶液[TCA∶正丁醇=1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（體積比），TCA 濃度 20%]，30℃、185 r/min振蕩2 h，后將其轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置2 h，待分層后取下層溶液，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.5 TCA-Sevag法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，按TCA法脫除一次，再用Sevag法脫除一次，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.6 聚酰胺法

將聚酰胺用95%乙醇浸泡2 h后傾去乙醇，再用蒸餾水浸泡2 h，使其充分溶脹，超聲除去氣泡后備用。取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%溶脹好的聚酰胺，攪勻，室溫振蕩3 h，抽濾，取濾液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.2.7 酶法

取20 mL菠蘿皮渣粗多糖溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.0，分別加入 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的木瓜蛋白酶，攪勻，60℃水浴振蕩水解3 h，沸水浴滅酶5 min，冷卻至室溫后4 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

1.3.3 菠蘿皮渣粗多糖脫色

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

采用活性炭對脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色，分別探討活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和樣液pH值對多糖溶液的脫色效果。單因素試驗(yàn)設(shè)定為：固定樣液pH值為6.0，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為60 min，活性炭加入量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。固定樣液pH值為6.0，脫色時(shí)間為60 min，活性炭加入量為 2.5%，脫色溫度分別為 30、40、50、60℃；固定樣液pH值為6.0，活性炭加入量為2.5%，脫色溫度為 50 ℃，脫色時(shí)間分別為 20、40、60、80、100、120 min；固定活性炭加入量為2.5%，脫色溫度為50℃，脫色時(shí)間為 80 min，樣液 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取活性炭添加量（A）、脫色溫度（B）、脫色時(shí)間（C）和樣液 pH 值（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，按L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 菠蘿皮渣精多糖體外抗氧化活性

1.3.4.1 DPPH·清除能力測定

將初步純化后的菠蘿皮渣粗多糖溶液經(jīng)蒸餾水透析2 d，濃縮醇沉，冷凍干燥制得菠蘿皮渣精多糖。取適量精多糖配制成質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液，各取2 mL于不同具塞試管中，每管均加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度Ai。以無水乙醇代替DPPH溶液測定吸光度Aj，以蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度A0。以不同濃度VC溶液（0.1 mg/mL～3.0 mg/mL）作陽性對照，以上試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為不同多糖濃度下的吸收度；Aj為不同濃度多糖溶液本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測定

各取50 μL不同質(zhì)量濃度的菠蘿皮渣精多糖溶液（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL），加入 4 mL ABTS+反應(yīng)液，混勻，避光反應(yīng)6 min，在732 nm處測定吸光度Ax，以甲醇作空白對照測定吸光度A0。以不同濃度VC溶液（0.1 mg/mL～3.0 mg/mL）作陽性對照，以上試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y1=0.011 0x1-0.000 2，R2=0.999 4。式中：x1為葡萄糖濃度，y1為吸光度。線性范圍為0～0.07 mg/mL。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y2=0.000 7x2+0.005 7，R2=0.999 6。式中：x2為蛋白質(zhì)含量，y2為吸光度。線性范圍為0～1.0 mg。

1.3.5.3 脫色率的測定

將經(jīng)脫蛋白后的菠蘿皮渣多糖溶液在波長為200 nm～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜全波長掃描，結(jié)果表明多糖溶液在323 nm下有最大吸收峰，故選擇323 nm為檢測波長測定菠蘿皮渣多糖溶液脫色前、后的吸光度。

1.3.6 計(jì)算公式

1.3.6.1 多糖保留率

1.3.6.2 脫蛋白率

1.3.6.3 脫色率

1.3.6.4 綜合指標(biāo)

比較蛋白質(zhì)和色素的脫除效果，要綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率（或脫色率）和多糖保留率兩方面的結(jié)果，本試驗(yàn)采用綜合評分作為蛋白質(zhì)和色素脫除效果的評價(jià)指標(biāo)，以指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，脫蛋白率（或脫色率）和多糖保留率的權(quán)重系數(shù)各為0.5。計(jì)算公式如下：

式中：X為脫蛋白率或脫色率；Y為多糖保留率，Xmax為蛋白質(zhì)或色素脫除率最大值；Ymax為多糖保留率最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白

2.1.1 鹽析法

硫酸銨粉末飽和度對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖1。

圖1 硫酸銨粉末飽和度對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.1 Effects of saturation of ammonium sulfate powder on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖1可知，隨著硫酸銨粉末飽和度的增加，多糖保留率持續(xù)降低，而蛋白質(zhì)脫除率呈先增大后減小趨勢，當(dāng)硫酸銨飽和度為70%時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大，此時(shí)脫蛋白率為60.45%，多糖保留率為36.78%。硫酸銨飽和度低，蛋白質(zhì)沉淀不完全，蛋白質(zhì)脫除率較低；硫酸銨飽和度高，鹽的濃度高，所得沉淀多為蛋白酸銨，反而不利于蛋白質(zhì)的沉淀，且鹽濃度過高時(shí)，會(huì)增加后續(xù)脫鹽難度及生產(chǎn)成本，同時(shí)多糖損失嚴(yán)重。綜合考慮脫蛋白率和多糖保留率，當(dāng)硫酸銨飽和度為10%時(shí)，評分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為33.55%，多糖保留率為80.79%。

2.1.2 三氯乙酸法

三氯乙酸濃度對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，而多糖保留率持續(xù)下降。TCA濃度較低時(shí)，其只能結(jié)合多糖中的一部分蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)脫除率低；隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，但TCA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成沉淀，會(huì)吸附部分多糖，導(dǎo)致多糖保留率降低[16]。綜合評價(jià)表明，當(dāng)TCA濃度為3%時(shí)評分值達(dá)到最大值，此時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為69.72%，多糖保留率為73.54%。

圖2 TCA濃度對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.2 Effects of TCA concentration on deproteinization and polysaccharides retention rate

2.1.3 Sevag法

脫蛋白次數(shù)對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖3。

圖3 脫蛋白次數(shù)對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.3 Effects of deproteinization times on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖3可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，用Sevag試劑處理1次，蛋白質(zhì)脫除率為11.36%，處理7次后，蛋白質(zhì)脫除率為48.18%。多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加呈逐漸下降的趨勢，Sevag試劑處理1次時(shí)，多糖保留率為91.15%，處理7次后多糖保留率為76.31%。從綜合指標(biāo)來看，處理7次時(shí)評分達(dá)到最大值，表明用Sevag試劑處理多次后，蛋白質(zhì)脫除率明顯提高，但多糖損失較多，這可能是由于Sevag試劑在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)造成多糖的損失[17]；此外，脫蛋白次數(shù)越多，重復(fù)操作過程也可能造成多糖的損失。

2.1.4 TCA-正丁醇法

TCA與正丁醇體積比對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖4。

圖4 TCA與正丁醇體積比對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.4 Effects of the volume of TCA and n-butanol on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖4可知，隨著TCA與正丁醇體積比的增大，蛋白質(zhì)脫除率呈先增大后減小趨勢，當(dāng)二者體積比為1∶10時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率和綜合評分值均達(dá)到最大值。此時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為81.47%，多糖保留率為85.91%。當(dāng)TCA與正丁醇體積比低于或高于1∶10時(shí)，多糖損失雖較少，但脫蛋白效果均不理想。

2.1.5 TCA-Sevag法

TCA-Sevag法脫蛋白次數(shù)對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖5。

圖5 TCA-Sevag法脫蛋白次數(shù)對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.5 Effects of TCA-Sevag deproteinization times on deproteinization and polysaccharides retention rate

如圖5可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，菠蘿皮渣粗多糖蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，連續(xù)操作2次后，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到83.17%，此后繼續(xù)增加重復(fù)操作次數(shù)，蛋白質(zhì)脫除率增大不顯著。多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加逐漸降低，在重復(fù)操作3次后，多糖保留率為62.80%。綜合評價(jià)表明，重復(fù)操作4次后評分值達(dá)到最大，此時(shí)脫蛋白率和多糖保留率分別為86.86%和62.07%。

2.1.6 聚酰胺法

聚酰胺添加量對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖6。

圖6 聚酰胺添加量對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.6 Effects of the dosage of polyamide on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖6可知，隨著聚酰胺添加量的增大，菠蘿皮渣粗多糖溶液蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，而多糖保留率呈緩慢降低趨勢。當(dāng)聚酰胺添加量為2.0%時(shí)，綜合評分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為88.78%，多糖保留率為70.51%。

2.1.7 酶法

木瓜蛋白酶添加量對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響見圖7。

圖7 木瓜蛋白酶添加量對脫蛋白率和多糖保留率的影響Fig.7 Effects of the protease dosage on deproteinization and polysaccharides retention rate

由圖7可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，菠蘿皮渣粗多糖溶液的脫蛋白率逐漸增大，當(dāng)酶用量大于2.5%時(shí)，酶用量的增加對脫蛋白率無顯著影響，而多糖保留率隨著酶用量的增加呈緩慢降低趨勢。在底物量一定的條件下，增大酶用量，使底物與酶接觸的機(jī)會(huì)增大，反應(yīng)效率提高，脫蛋白率增大；但由于底物量有限，繼續(xù)增加酶用量不能使反應(yīng)效率持續(xù)升高[18]。綜合評分表明木瓜蛋白酶添加量為2.5%時(shí)評分值達(dá)到最大，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為30.49%，多糖保留率為88.15%。

2.1.8 脫蛋白方法的比較

7種脫蛋白方法對菠蘿皮渣粗多糖脫蛋白率和多糖保留率的影響，結(jié)果見表2。

表2 7種脫蛋白方法的比較Table 2 Comparison of seven deproteinization methods

由表2可知，聚酰胺法蛋白質(zhì)脫除率最高，但多糖保留率低于鹽析法、TCA-正丁醇法和酶法；TCA-正丁醇法的蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率均較高；鹽析法和酶法多糖損失雖較少，但蛋白質(zhì)脫除率均較低。綜合加權(quán)評分法分析表明TCA-正丁醇法的評分值最高，故后續(xù)試驗(yàn)采用TCA-正丁醇法對菠蘿皮渣粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理。

2.2 活性炭脫色工藝研究

2.2.1 活性炭添加量對脫色效果的影響

活性炭添加量對菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見圖8。

圖8 活性炭添加量對脫色率和多糖保留率的影響Fig.8 Effects of amounts of active carbon on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖8可知，隨著活性炭添加量的增加，脫色率呈遞增趨勢，且差異顯著；多糖保留率隨著活性炭添加量的增加緩慢降低，這可能是由于活性炭加入量過大，對多糖產(chǎn)生少量吸附作用所致。為了保證脫色率和多糖保留率均在較高水平，選擇活性炭添加量為2.0%～3.0%來開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 脫色溫度對脫色效果的影響

脫色溫度對菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見圖9。

圖9 脫色溫度對脫色率和多糖保留率的影響Fig.9 Effects of decolorating temperature on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖9可知，隨著脫色溫度的升高，脫色率逐漸增大，當(dāng)脫色溫度為50℃時(shí)，脫色率達(dá)到最大，此后繼續(xù)延長脫色溫度，脫色率增大不顯著。這可能是由于隨著溫度的升高，多糖溶液的黏度降低，色素分子運(yùn)動(dòng)加快，進(jìn)而加速了活性炭的吸附作用，直至吸附達(dá)到飽和[19]。多糖保留率隨脫色溫度的升高降低不顯著，說明在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)多糖損失較少。綜合考慮，選擇脫色溫度為40℃～60℃來開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 脫色時(shí)間對脫色效果的影響

脫色時(shí)間對菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見圖10。

圖10 脫色時(shí)間對脫色率和多糖保留率的影響Fig.10 Effects of decolorating time on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖10可知，隨著脫色時(shí)間的延長，脫色率呈緩慢增大趨勢，當(dāng)脫色時(shí)間超過60 min后，脫色率增大不顯著，這可能是由于活性炭吸附已達(dá)到飽和，吸附與解析處于相對平衡。多糖保留率隨著脫色時(shí)間的延長緩慢降低，且降幅較小。綜合考慮脫色率和多糖保留率，選擇適宜的脫色時(shí)間為60 min～100 min。

2.2.4 樣液pH值對脫色效果的影響

樣液pH值對菠蘿皮渣粗多糖脫色率和多糖保留率的影響見圖11。

圖11 樣液pH值對脫色率和多糖保留率的影響Fig.11 Effects of pH value on decoloration and polysaccharides retention rate

由圖11可知，樣液pH值在酸性或偏酸性環(huán)境中，脫色效果較好，在中性或偏堿性環(huán)境中，脫色率明顯降低，說明活性炭在偏酸性條件下吸附作用較好。而多糖保留率隨樣液pH值的增大呈先增大后減小趨勢，當(dāng)樣液pH值為4.0時(shí)，多糖保留率達(dá)到最大。綜合考慮脫色率和多糖保留率，確定適宜的樣液pH值范圍為 3.0～5.0。

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3、表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

續(xù)表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Analysis of variance and results of significance test

由表3和表4可知，影響活性炭脫色綜合評分的因素大小順序?yàn)椋篈＞D＞B＞C，即活性炭添加量對脫色效果影響最大，其次為樣液pH值，再者為脫色溫度，脫色時(shí)間對脫色效果影響最小?；钚蕴棵撋淖罴压に嚄l件為A3B3C2D2，即活性炭添加為量3.0%，脫色溫度為60℃，脫色時(shí)間為80 min，樣液pH值為4.0。按優(yōu)化的工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得脫色率為64.60%，多糖保留率為83.97%，表明試驗(yàn)優(yōu)化的最佳脫色工藝條件可靠。

2.3 菠蘿皮渣精多糖體外抗氧化活性分析

DPPH·能與抗氧化物提供的一個(gè)電子配對使其特征紫色消失，可根據(jù)其褪色程度來間接評價(jià)抗氧化物的抗氧化能力。菠蘿皮渣精多糖對DPPH·和ABTS+·的清除效果見圖12。由圖12可知，菠蘿皮渣精多糖對DPPH·的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，在3.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到83.27%，略低于同濃度VC溶液的DPPH·清除率，說明菠蘿皮渣精多糖具有良好的體外抗氧化能力。此外，菠蘿皮渣精多糖具有一定的清除ABTS+自由基的能力，隨著多糖濃度的增加，ABTS+自由基清除率也逐漸增大。當(dāng)濃度為3.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到49.12%，但低于同濃度VC溶液的ABTS+自由基清除率。

圖12 菠蘿皮渣精多糖對DPPH·和ABTS+自由基的清除效果Fig.12 Scavenging effects of polysaccharides from pineapple pomace on DPPH·and ABTS+radical

3 結(jié)論

本研究采用7種方法對菠蘿皮渣粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，結(jié)果表明TCA-正丁醇法的脫蛋白效果較好，其脫蛋白率為81.47%，多糖保留率為85.91%。采用活性炭對脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行脫色處理，分別考察了活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和樣液pH值對脫色效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳脫色工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)因素對脫色效果的影響主次順序?yàn)椋夯钚蕴刻砑恿浚緲右簆H值＞脫色溫度＞脫色時(shí)間。適宜的脫色工藝為活性炭添加量3.0%，脫色溫度60℃，脫色時(shí)間80 min，樣液pH值4.0，在此條件下，脫色率為64.60%，多糖保留率為83.97%。經(jīng)初步純化制得的菠蘿皮渣精多糖對DPPH·和ABTS+自由基均有一定的清除作用，在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，清除率分別為83.27%和49.12%。由此可見，經(jīng)本研究篩選的脫蛋白、脫色方法切實(shí)可行，制得的菠蘿皮渣精多糖具有良好的抗氧化活性，可為菠蘿皮渣精多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。