(河南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院,河南鄭州450001)
疲勞是涉及許多生理和生化作用的一種機(jī)體復(fù)雜綜合癥狀,也是腦力或體力活動(dòng)達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)必須發(fā)生的機(jī)體生理保護(hù)現(xiàn)象[1]。疲勞不僅使機(jī)體工作能力暫時(shí)下降,而且還是機(jī)體處于亞健康狀態(tài)或發(fā)展成疾病狀態(tài)的前兆,表明機(jī)體的健康即將或已經(jīng)受到損害。根據(jù)癥狀表現(xiàn)不同,疲勞可分為體力和腦力疲勞。體力疲勞(也稱外周疲勞)主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力下降,機(jī)體不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。腦力疲勞主要表現(xiàn)為意志和行為的負(fù)面變化,如精神失常、健忘、失眠、抑郁、頭暈等。體力疲勞是影響機(jī)體健康的重要因素之一,長(zhǎng)期持續(xù)體力疲勞可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體過(guò)早衰老、患腫瘤、心腦血管等疾病風(fēng)險(xiǎn)增高[2]。在過(guò)去的幾十年里,研究人員對(duì)體力疲勞的機(jī)理進(jìn)行了眾多研究,并提出了各種理論,如阻塞理論、能源物質(zhì)耗竭理論、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)理論、保護(hù)抑制理論、突變理論、自由基理論等[3],其中,自由基理論最受關(guān)注。自由基能引起線粒體呼吸鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)過(guò)程受損,使細(xì)胞能量合成發(fā)生障礙,影響肌纖維收縮功能;另外,運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體代謝增強(qiáng),耗氧量增加,導(dǎo)致機(jī)體各組織中產(chǎn)生過(guò)多的自由基與活性氧(reactive oxy gen species,ROS),這可能超過(guò)機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)(酶與非酶)的清除能力,產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過(guò)量的自由基與ROS可以攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等細(xì)胞大分子,從而使正常的細(xì)胞功能惡化,出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等現(xiàn)象而產(chǎn)生疲勞[4]。近年來(lái)的研究已證實(shí),外源性抗氧化劑可通過(guò)抑制或阻止細(xì)胞內(nèi)可氧化底物的氧化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、直接清除自由基或與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)降低氧化應(yīng)激,延遲體力疲勞[5]。因此,對(duì)機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是延緩體力疲勞的一種行之有效的方法。近些年,一些多糖、皂苷、黃酮類化合物、小分子肽類等天然抗氧化活性成分已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗疲勞作用[3,6-7]。
白藜蘆醇(3,4',5-三羥基芪,resveratrol)為二苯乙烯類的多酚類化合物,是植物面對(duì)病原體感染和各種自然惡劣條件下而產(chǎn)生的一種天然植物化學(xué)物質(zhì)。目前白藜蘆醇已在葡萄、花生、部分漿果及草藥等70多種植物中被發(fā)現(xiàn),其中葡萄皮中含量最高,可達(dá)50 mg/kg~100 mg/kg[8]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗衰老、抗病毒、保護(hù)肝與腎及免疫調(diào)節(jié)作用[9]。此外,白藜蘆醇在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化活性,能有效的清除各類自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[10-11]。鑒于白藜蘆醇的強(qiáng)抗氧化性,可以推測(cè)白藜蘆醇有可能與機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶協(xié)同作用,清除劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的過(guò)量自由基、降低氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗疲勞作用。因此,本研究采用力竭訓(xùn)練動(dòng)物模型,在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,分別灌胃不同劑量白藜蘆醇,測(cè)定其抗疲勞效果,并從不同角度入手,探尋其抗疲勞可能的機(jī)制,這將為白藜蘆醇在運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
1.1.1 化學(xué)品與試劑
白藜蘆醇(純度99%):北京萊耀生物科技有限公司;血乳酸(blood lactic acid,BLA)測(cè)定試劑盒:北京雷根生物技術(shù)有限公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)測(cè)定試劑盒:中生北控生物科技有限公司;肝、肌糖原測(cè)定試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒:南京建城生物技術(shù)研究所;試驗(yàn)中所使用的其他化學(xué)品均為分析純,試劑的配制采用雙蒸水。
1.1.2 主要儀器
ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái):安徽正華生物儀器設(shè)備公司;UV5型分光光度計(jì):瑞士梅特勒-托利多公司;HH-501型水浴鍋:江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;5424R臺(tái)式離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司;ELx808型酶標(biāo)儀:美國(guó)Biotek公司;QL-901型旋渦混合器:海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重180 g~200 g):河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)室,保持12 h的晝夜循環(huán),室內(nèi)溫度控制在(22±2)℃,濕度控制在(50±5)%;動(dòng)物自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料與水。
1.2.1 動(dòng)物分組與治療
經(jīng)過(guò)7 d適應(yīng)環(huán)境后,將大鼠按體重隨機(jī)分為4組,每組8只,分別是低劑量白藜蘆醇組(low-dose resveratrol treatment group,L-ReG)、中劑量白藜蘆醇組(medium-dose resveratrol treatment group,M-ReG)、高劑量白藜蘆醇組(high dose resveratrol treatment group,H-ReG)、空白對(duì)照組(control group,CG)。3個(gè)白藜蘆醇組分別接受25、50、100 mg/kg·bw劑量的白藜蘆醇灌胃治療(劑量選擇來(lái)自于預(yù)實(shí)驗(yàn),白藜蘆醇溶于1.0 mL蒸餾水中制成懸浮液),空白對(duì)照組接受等劑量蒸餾水,每天一次,連續(xù)4周。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格依照《國(guó)務(wù)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》以及《河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行,并被河南工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.2.2 大鼠跑步運(yùn)動(dòng)
大鼠跑步運(yùn)動(dòng)包括適應(yīng)性訓(xùn)練、強(qiáng)化訓(xùn)練及力竭實(shí)驗(yàn)。第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,藥物灌胃30 min后,將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上(跑道規(guī)格為1 000 mm×90 mm×120 mm)進(jìn)行跑步20 min訓(xùn)練(坡度傾角設(shè)置為0°,速度15 m/min);第2~4周進(jìn)行強(qiáng)化訓(xùn)練,藥物灌胃30 min后,將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行跑步20 min訓(xùn)練(坡度傾角設(shè)置為0°,速度30 m/min);第4周最后一天(第28天),藥物灌胃30 min后,將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行力竭跑步實(shí)驗(yàn),坡度傾角設(shè)置為10°,以速度30 m/min跑步至力竭。力竭被定義為大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng),呼吸急促、俯臥垂頭、滯留跑道后端,經(jīng)電刺激后仍無(wú)效,且抓起大鼠時(shí)無(wú)掙扎動(dòng)作[12]。記錄力竭跑步時(shí)間。
1.2.3 疲勞相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定
力竭跑步結(jié)束后,將大鼠在乙醚麻醉后剖開(kāi)腹腔,腹主動(dòng)脈取血,儲(chǔ)存在-80℃用于分析BLA與BUN;然后快速切除肝臟與股四頭肌,用預(yù)冷生理鹽水漂洗后濾紙吸干,然后儲(chǔ)存在-80℃用于測(cè)定肝、肌糖原含量以及肝組織中SOD、GPx、CAT、MDA的含量。所有生化指標(biāo)測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
測(cè)定結(jié)果用mean±SD表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進(jìn)行過(guò)單因素方差(ANOVA)分析,組間比較用Post Hoc檢驗(yàn),p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,耐力增強(qiáng)代表著疲勞感降低,因此判定藥物抗疲勞作用最直接指標(biāo)是運(yùn)動(dòng)耐力的強(qiáng)弱[13]。動(dòng)物力竭跑步運(yùn)動(dòng)一種實(shí)驗(yàn)性運(yùn)動(dòng)模型,很適合評(píng)價(jià)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力,并具有良好的重現(xiàn)性,力竭時(shí)間的長(zhǎng)短能夠客觀反映藥物抗疲勞能力[14]。白藜蘆醇對(duì)大鼠力竭跑步時(shí)間的影響見(jiàn)圖1。
由圖1可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組(L-ReG、M-ReG、H-ReG)力竭跑步時(shí)間均顯著增加(p<0.05),增加率分別為13.59%、25.60%、34.73%。這表明,白藜蘆醇能延長(zhǎng)大鼠力竭跑步時(shí)間,增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力,具有抗疲勞作用。
圖1 白藜蘆醇對(duì)大鼠力竭跑步時(shí)間的影響Fig.1 Effects of resveratrol on the exhausted running time of rats
糖酵解是劇烈運(yùn)動(dòng)的主要能量來(lái)源。當(dāng)肌肉從無(wú)氧酵解中獲得足夠能量時(shí),會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量乳酸(碳水化合物的糖酵解產(chǎn)物);乳酸濃度的增加會(huì)降低肌肉和血液中pH值,從而引起各種生理和生化副作用而產(chǎn)生疲勞。減少乳酸的堆積或快速清除乳酸有利于緩解體力疲勞[15]。因此,BLA是體力疲勞的敏感指標(biāo)之一。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血乳酸的影響見(jiàn)圖2。
圖2 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血乳酸的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the blood lactic acid of rats
由圖2可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組(L-ReG、M-ReG、H-ReG)BLA含量顯著降低(p<0.05),降低率分別為 15.82%、19.42%、34.58%。這說(shuō)明,白藜蘆醇能減少運(yùn)動(dòng)后乳酸的堆積或快速清除乳酸,從而緩解疲勞。
尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物。尿素在肝臟中形成,是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,由血液攜帶到腎臟排泄[16]。當(dāng)碳水化合物和脂肪分解代謝所產(chǎn)能量無(wú)法滿足機(jī)體需要時(shí),蛋白質(zhì)和氨基酸就開(kāi)始分解代謝以滿足能量需求。BUN含量增加會(huì)反映出蛋白質(zhì)和氨基酸的分解加劇,這會(huì)破壞肌肉收縮力并最終導(dǎo)致體力疲勞。BUN和運(yùn)動(dòng)耐力之間存在負(fù)相關(guān),即機(jī)體能夠適應(yīng)運(yùn)動(dòng)耐力程度越低,BUN增加就越顯著[17]。因此,BUN是體力疲勞的另一敏感指標(biāo)。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血尿素氮的影響見(jiàn)圖3。
圖3 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血尿素氮的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the blood urea nitrogen of rats
由圖3可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,中、高劑量白藜蘆醇組(M-ReG、H-ReG)BUN含量顯著降低(p<0.05),降低率分別為 14.98%、24.14%;低劑量白藜蘆醇組(L-ReG)BUN含量雖然也輕微降低,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。這說(shuō)明,白藜蘆醇能減少BUN的積累,降低蛋白質(zhì)代謝而緩解疲勞。
運(yùn)動(dòng)耐力強(qiáng)弱與能量?jī)?chǔ)存及供應(yīng)密切相關(guān)。糖原作為能量的重要來(lái)源,用于補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)期間的血糖消耗,并維持血糖穩(wěn)定在生理范圍內(nèi)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí),首先肌糖原被耗盡,接著肝糖原氧化分解產(chǎn)生葡萄糖來(lái)提供血糖;當(dāng)肝糖原被耗盡時(shí)會(huì)發(fā)生體力疲勞[18]。增加糖原的儲(chǔ)存或減少糖原的消耗可提高運(yùn)動(dòng)耐力,延遲疲勞的發(fā)生。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝、肌糖原的影響見(jiàn)圖4。
圖4 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝、肌糖原的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the liver and muscular glycogen of rats
由圖4可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組(L-ReG、M-ReG、H-ReG)肝、肌糖原含量顯著增加(p<0.05),肝糖原增加率分別為28.27%、57.24%、69.16%;肌糖原增加率分別為27.58%、37.07%、47.41%。這說(shuō)明,白藜蘆醇能改善運(yùn)動(dòng)代謝控制和能量代謝活化,通過(guò)增加肝、肌肉糖原的儲(chǔ)存來(lái)改善體力疲勞。
劇烈運(yùn)動(dòng)造成耗氧量增加,產(chǎn)生大量活性氧(ROS)與自由基,導(dǎo)致體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生紊亂產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過(guò)量的ROS與自由基能攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等,造成氧化損傷。此外,ROS不僅能直接影響能量供應(yīng)和興奮-收縮偶聯(lián)過(guò)程中的酶活性,而且還加速BLA和SUN的積累[19]。正常情況下,機(jī)體有酶和非酶抗氧化劑這兩種主要的內(nèi)源性防御系統(tǒng),能減少ROS與自由基的有害作用,降低氧化應(yīng)激。SOD、GPx、CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD是超氧自由基清除因子,能將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2;GPx將H2O2或氫過(guò)氧化物還原成H2O和醇;CAT能催化H2O2分解成H2O和O2[20]。但這些抗氧化酶在疲勞和其他疾病狀況下會(huì)發(fā)生減弱現(xiàn)象。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織抗氧化酶的影響見(jiàn)圖5。
圖5 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織抗氧化酶的影響Fig.5 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme in liver of rats
由圖5可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組(L-ReG、M-ReG、H-ReG)SOD與GPx含量顯著增加(p<0.05),SOD增加率分別為22.19%、33.71%、36.55%;GPx增加率分別為12.98%、16.39%、25.60%。中、高劑量白藜蘆醇組(M-ReG、HReG)CAT含量顯著增加(p<0.05),增加率分別為15.19%、22.88%;低劑量白藜蘆醇組(L-ReG)CAT含量雖然也輕微增加,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。這說(shuō)明,白藜蘆醇不僅能作為外源性抗氧化劑直接延緩疲勞,而且還能提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性,與內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激,發(fā)揮抗疲勞作用。
研究已經(jīng)證實(shí),劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生ROS與自由基會(huì)破壞線粒體功能,使其失去作為電子傳遞鏈組分的能力,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生并進(jìn)一步造成氧化損傷[21]。丙二醛(MDA)是自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化主要產(chǎn)物,也是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激最敏感的生物標(biāo)志物之一[22]。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織丙二醛的影響見(jiàn)圖6。
圖6 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織丙二醛的影響Fig.6 Effects of resveratrol on the MDA in liver of rats
由圖6可以看出,與空白對(duì)照組(CG)組相比,3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組(L-ReG、M-ReG、H-ReG)MDA含量顯著降低(p<0.05),降低率分別為18.21%、24.14%、28.07%。這說(shuō)明,白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化,保護(hù)肝細(xì)胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài),進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力,促進(jìn)疲勞恢復(fù)。
白藜蘆醇具有抗疲勞作用,其能延長(zhǎng)大鼠力竭跑步時(shí)間;降低BLA、BUN、肝組織中MDA含量;增加肝糖原、肌糖原以及肝組織中SOD、GPx、CAT含量。白藜蘆醇抗疲勞作用機(jī)理其機(jī)制可能與以下因素有關(guān):
1)白藜蘆醇能降低代謝產(chǎn)物的堆積或快速清除代謝產(chǎn)物來(lái)延緩疲勞。
2)白藜蘆醇能改善運(yùn)動(dòng)代謝控制和能量代謝活化,通過(guò)增加肝、肌肉糖原的儲(chǔ)存來(lái)改善疲勞。
3)白藜蘆醇能提高體內(nèi)抗氧化酶活性,與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)降低氧化應(yīng)激,發(fā)揮抗疲勞作用。
4)白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化,保護(hù)肝細(xì)胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài),進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力,促進(jìn)疲勞恢復(fù)。