（河南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，河南鄭州450001）

疲勞是涉及許多生理和生化作用的一種機(jī)體復(fù)雜綜合癥狀，也是腦力或體力活動(dòng)達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)必須發(fā)生的機(jī)體生理保護(hù)現(xiàn)象[1]。疲勞不僅使機(jī)體工作能力暫時(shí)下降，而且還是機(jī)體處于亞健康狀態(tài)或發(fā)展成疾病狀態(tài)的前兆，表明機(jī)體的健康即將或已經(jīng)受到損害。根據(jù)癥狀表現(xiàn)不同，疲勞可分為體力和腦力疲勞。體力疲勞（也稱外周疲勞）主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力下降，機(jī)體不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。腦力疲勞主要表現(xiàn)為意志和行為的負(fù)面變化，如精神失常、健忘、失眠、抑郁、頭暈等。體力疲勞是影響機(jī)體健康的重要因素之一，長(zhǎng)期持續(xù)體力疲勞可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體過(guò)早衰老、患腫瘤、心腦血管等疾病風(fēng)險(xiǎn)增高[2]。在過(guò)去的幾十年里，研究人員對(duì)體力疲勞的機(jī)理進(jìn)行了眾多研究，并提出了各種理論，如阻塞理論、能源物質(zhì)耗竭理論、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)理論、保護(hù)抑制理論、突變理論、自由基理論等[3]，其中，自由基理論最受關(guān)注。自由基能引起線粒體呼吸鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）過(guò)程受損，使細(xì)胞能量合成發(fā)生障礙，影響肌纖維收縮功能；另外，運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體代謝增強(qiáng)，耗氧量增加，導(dǎo)致機(jī)體各組織中產(chǎn)生過(guò)多的自由基與活性氧（reactive oxy gen species，ROS），這可能超過(guò)機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)（酶與非酶）的清除能力，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過(guò)量的自由基與ROS可以攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等細(xì)胞大分子，從而使正常的細(xì)胞功能惡化，出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等現(xiàn)象而產(chǎn)生疲勞[4]。近年來(lái)的研究已證實(shí)，外源性抗氧化劑可通過(guò)抑制或阻止細(xì)胞內(nèi)可氧化底物的氧化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、直接清除自由基或與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)降低氧化應(yīng)激，延遲體力疲勞[5]。因此，對(duì)機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是延緩體力疲勞的一種行之有效的方法。近些年，一些多糖、皂苷、黃酮類化合物、小分子肽類等天然抗氧化活性成分已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗疲勞作用[3，6-7]。

白藜蘆醇（3，4'，5-三羥基芪，resveratrol）為二苯乙烯類的多酚類化合物，是植物面對(duì)病原體感染和各種自然惡劣條件下而產(chǎn)生的一種天然植物化學(xué)物質(zhì)。目前白藜蘆醇已在葡萄、花生、部分漿果及草藥等70多種植物中被發(fā)現(xiàn)，其中葡萄皮中含量最高，可達(dá)50 mg/kg～100 mg/kg[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗衰老、抗病毒、保護(hù)肝與腎及免疫調(diào)節(jié)作用[9]。此外，白藜蘆醇在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化活性，能有效的清除各類自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[10-11]。鑒于白藜蘆醇的強(qiáng)抗氧化性，可以推測(cè)白藜蘆醇有可能與機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶協(xié)同作用，清除劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的過(guò)量自由基、降低氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗疲勞作用。因此，本研究采用力竭訓(xùn)練動(dòng)物模型，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別灌胃不同劑量白藜蘆醇，測(cè)定其抗疲勞效果，并從不同角度入手，探尋其抗疲勞可能的機(jī)制，這將為白藜蘆醇在運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學(xué)品與試劑

白藜蘆醇（純度99%）：北京萊耀生物科技有限公司；血乳酸（blood lactic acid，BLA）測(cè)定試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測(cè)定試劑盒：中生北控生物科技有限公司；肝、肌糖原測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒：南京建城生物技術(shù)研究所；試驗(yàn)中所使用的其他化學(xué)品均為分析純，試劑的配制采用雙蒸水。

1.1.2 主要儀器

ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：安徽正華生物儀器設(shè)備公司；UV5型分光光度計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-501型水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；5424R臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ELx808型酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；QL-901型旋渦混合器：海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體重180 g～200 g）：河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)室，保持12 h的晝夜循環(huán)，室內(nèi)溫度控制在（22±2）℃，濕度控制在（50±5）%；動(dòng)物自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料與水。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與治療

經(jīng)過(guò)7 d適應(yīng)環(huán)境后，將大鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組8只，分別是低劑量白藜蘆醇組（low-dose resveratrol treatment group，L-ReG）、中劑量白藜蘆醇組（medium-dose resveratrol treatment group，M-ReG）、高劑量白藜蘆醇組（high dose resveratrol treatment group，H-ReG）、空白對(duì)照組（control group，CG）。3個(gè)白藜蘆醇組分別接受25、50、100 mg/kg·bw劑量的白藜蘆醇灌胃治療（劑量選擇來(lái)自于預(yù)實(shí)驗(yàn)，白藜蘆醇溶于1.0 mL蒸餾水中制成懸浮液），空白對(duì)照組接受等劑量蒸餾水，每天一次，連續(xù)4周。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格依照《國(guó)務(wù)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》以及《河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并被河南工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 大鼠跑步運(yùn)動(dòng)

大鼠跑步運(yùn)動(dòng)包括適應(yīng)性訓(xùn)練、強(qiáng)化訓(xùn)練及力竭實(shí)驗(yàn)。第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上（跑道規(guī)格為1 000 mm×90 mm×120 mm）進(jìn)行跑步20 min訓(xùn)練（坡度傾角設(shè)置為0°，速度15 m/min）；第2～4周進(jìn)行強(qiáng)化訓(xùn)練，藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行跑步20 min訓(xùn)練（坡度傾角設(shè)置為0°，速度30 m/min）；第4周最后一天（第28天），藥物灌胃30 min后，將大鼠放在實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行力竭跑步實(shí)驗(yàn)，坡度傾角設(shè)置為10°，以速度30 m/min跑步至力竭。力竭被定義為大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng)，呼吸急促、俯臥垂頭、滯留跑道后端，經(jīng)電刺激后仍無(wú)效，且抓起大鼠時(shí)無(wú)掙扎動(dòng)作[12]。記錄力竭跑步時(shí)間。

1.2.3 疲勞相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定

力竭跑步結(jié)束后，將大鼠在乙醚麻醉后剖開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，儲(chǔ)存在-80℃用于分析BLA與BUN；然后快速切除肝臟與股四頭肌，用預(yù)冷生理鹽水漂洗后濾紙吸干，然后儲(chǔ)存在-80℃用于測(cè)定肝、肌糖原含量以及肝組織中SOD、GPx、CAT、MDA的含量。所有生化指標(biāo)測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)定結(jié)果用mean±SD表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進(jìn)行過(guò)單因素方差（ANOVA）分析，組間比較用Post Hoc檢驗(yàn)，p＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)大鼠力竭跑步時(shí)間的影響

在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，耐力增強(qiáng)代表著疲勞感降低，因此判定藥物抗疲勞作用最直接指標(biāo)是運(yùn)動(dòng)耐力的強(qiáng)弱[13]。動(dòng)物力竭跑步運(yùn)動(dòng)一種實(shí)驗(yàn)性運(yùn)動(dòng)模型，很適合評(píng)價(jià)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力，并具有良好的重現(xiàn)性，力竭時(shí)間的長(zhǎng)短能夠客觀反映藥物抗疲勞能力[14]。白藜蘆醇對(duì)大鼠力竭跑步時(shí)間的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）力竭跑步時(shí)間均顯著增加（p＜0.05），增加率分別為13.59%、25.60%、34.73%。這表明，白藜蘆醇能延長(zhǎng)大鼠力竭跑步時(shí)間，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力，具有抗疲勞作用。

圖1 白藜蘆醇對(duì)大鼠力竭跑步時(shí)間的影響Fig.1 Effects of resveratrol on the exhausted running time of rats

2.2 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血乳酸的影響

糖酵解是劇烈運(yùn)動(dòng)的主要能量來(lái)源。當(dāng)肌肉從無(wú)氧酵解中獲得足夠能量時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量乳酸（碳水化合物的糖酵解產(chǎn)物）；乳酸濃度的增加會(huì)降低肌肉和血液中pH值，從而引起各種生理和生化副作用而產(chǎn)生疲勞。減少乳酸的堆積或快速清除乳酸有利于緩解體力疲勞[15]。因此，BLA是體力疲勞的敏感指標(biāo)之一。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血乳酸的影響見(jiàn)圖2。

圖2 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血乳酸的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the blood lactic acid of rats

由圖2可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）BLA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 15.82%、19.42%、34.58%。這說(shuō)明，白藜蘆醇能減少運(yùn)動(dòng)后乳酸的堆積或快速清除乳酸，從而緩解疲勞。

2.3 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血尿素氮的影響

尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物。尿素在肝臟中形成，是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，由血液攜帶到腎臟排泄[16]。當(dāng)碳水化合物和脂肪分解代謝所產(chǎn)能量無(wú)法滿足機(jī)體需要時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸就開(kāi)始分解代謝以滿足能量需求。BUN含量增加會(huì)反映出蛋白質(zhì)和氨基酸的分解加劇，這會(huì)破壞肌肉收縮力并最終導(dǎo)致體力疲勞。BUN和運(yùn)動(dòng)耐力之間存在負(fù)相關(guān)，即機(jī)體能夠適應(yīng)運(yùn)動(dòng)耐力程度越低，BUN增加就越顯著[17]。因此，BUN是體力疲勞的另一敏感指標(biāo)。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血尿素氮的影響見(jiàn)圖3。

圖3 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠血尿素氮的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the blood urea nitrogen of rats

由圖3可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、H-ReG）BUN含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為 14.98%、24.14%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）BUN含量雖然也輕微降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。這說(shuō)明，白藜蘆醇能減少BUN的積累，降低蛋白質(zhì)代謝而緩解疲勞。

2.4 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝、肌糖原的影響

運(yùn)動(dòng)耐力強(qiáng)弱與能量?jī)?chǔ)存及供應(yīng)密切相關(guān)。糖原作為能量的重要來(lái)源，用于補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)期間的血糖消耗，并維持血糖穩(wěn)定在生理范圍內(nèi)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，首先肌糖原被耗盡，接著肝糖原氧化分解產(chǎn)生葡萄糖來(lái)提供血糖；當(dāng)肝糖原被耗盡時(shí)會(huì)發(fā)生體力疲勞[18]。增加糖原的儲(chǔ)存或減少糖原的消耗可提高運(yùn)動(dòng)耐力，延遲疲勞的發(fā)生。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝、肌糖原的影響見(jiàn)圖4。

圖4 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝、肌糖原的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the liver and muscular glycogen of rats

由圖4可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）肝、肌糖原含量顯著增加（p＜0.05），肝糖原增加率分別為28.27%、57.24%、69.16%；肌糖原增加率分別為27.58%、37.07%、47.41%。這說(shuō)明，白藜蘆醇能改善運(yùn)動(dòng)代謝控制和能量代謝活化，通過(guò)增加肝、肌肉糖原的儲(chǔ)存來(lái)改善體力疲勞。

2.5 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織抗氧化酶的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)造成耗氧量增加，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）與自由基，導(dǎo)致體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生紊亂產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過(guò)量的ROS與自由基能攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等，造成氧化損傷。此外，ROS不僅能直接影響能量供應(yīng)和興奮-收縮偶聯(lián)過(guò)程中的酶活性，而且還加速BLA和SUN的積累[19]。正常情況下，機(jī)體有酶和非酶抗氧化劑這兩種主要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)，能減少ROS與自由基的有害作用，降低氧化應(yīng)激。SOD、GPx、CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD是超氧自由基清除因子，能將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2；GPx將H2O2或氫過(guò)氧化物還原成H2O和醇；CAT能催化H2O2分解成H2O和O2[20]。但這些抗氧化酶在疲勞和其他疾病狀況下會(huì)發(fā)生減弱現(xiàn)象。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織抗氧化酶的影響見(jiàn)圖5。

圖5 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織抗氧化酶的影響Fig.5 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme in liver of rats

由圖5可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）SOD與GPx含量顯著增加（p＜0.05），SOD增加率分別為22.19%、33.71%、36.55%；GPx增加率分別為12.98%、16.39%、25.60%。中、高劑量白藜蘆醇組（M-ReG、HReG）CAT含量顯著增加（p＜0.05），增加率分別為15.19%、22.88%；低劑量白藜蘆醇組（L-ReG）CAT含量雖然也輕微增加，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。這說(shuō)明，白藜蘆醇不僅能作為外源性抗氧化劑直接延緩疲勞，而且還能提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性，與內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗疲勞作用。

2.6 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織丙二醛的影響

研究已經(jīng)證實(shí)，劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生ROS與自由基會(huì)破壞線粒體功能，使其失去作為電子傳遞鏈組分的能力，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生并進(jìn)一步造成氧化損傷[21]。丙二醛（MDA）是自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化主要產(chǎn)物，也是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激最敏感的生物標(biāo)志物之一[22]。白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織丙二醛的影響見(jiàn)圖6。

圖6 白藜蘆醇對(duì)運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織丙二醛的影響Fig.6 Effects of resveratrol on the MDA in liver of rats

由圖6可以看出，與空白對(duì)照組（CG）組相比，3個(gè)不同劑量白藜蘆醇組（L-ReG、M-ReG、H-ReG）MDA含量顯著降低（p＜0.05），降低率分別為18.21%、24.14%、28.07%。這說(shuō)明，白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)肝細(xì)胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài)，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，促進(jìn)疲勞恢復(fù)。

3 結(jié)論

白藜蘆醇具有抗疲勞作用，其能延長(zhǎng)大鼠力竭跑步時(shí)間；降低BLA、BUN、肝組織中MDA含量；增加肝糖原、肌糖原以及肝組織中SOD、GPx、CAT含量。白藜蘆醇抗疲勞作用機(jī)理其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：

1）白藜蘆醇能降低代謝產(chǎn)物的堆積或快速清除代謝產(chǎn)物來(lái)延緩疲勞。

2）白藜蘆醇能改善運(yùn)動(dòng)代謝控制和能量代謝活化，通過(guò)增加肝、肌肉糖原的儲(chǔ)存來(lái)改善疲勞。

3）白藜蘆醇能提高體內(nèi)抗氧化酶活性，與內(nèi)源性抗氧化劑形成協(xié)同抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)降低氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗疲勞作用。

4）白藜蘆醇能減少自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)肝細(xì)胞膜完整性并維持肝臟正常生理狀態(tài)，進(jìn)而提高運(yùn)動(dòng)耐力，促進(jìn)疲勞恢復(fù)。