孟憲菁，楊 斌，李 安，賈曉藝，朱 湘，馬 瀟，尹 松

(1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 勐侖 666303；2.賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，上海 201206；3.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，北京 100097；4.三門峽市陜州區(qū)農(nóng)業(yè)畜牧局，河南 三門峽 472100；5.普洱學(xué)院，云南 普洱 665000)

基于快速燃燒的原理，連續(xù)流技術(shù)的元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(EA-IRMS)在線聯(lián)機(jī)系統(tǒng)可以將固體或粘稠狀樣品中有機(jī)碳(C)、總氮(N)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2和N2，實(shí)現(xiàn)了碳和氮的穩(wěn)定同位素組成(δ13C和δ15N)的高精度測(cè)量[1-3]。IRMS測(cè)定樣品氣體時(shí)，需要引入1個(gè)已知同位素值的參考?xì)怏w作對(duì)照[4]。為保證測(cè)定結(jié)果的可靠性，樣品氣與參考?xì)獾馁|(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度要盡量接近[5]。由于自然界中樣品C、N元素含量和C/N的變化極大，并且不同元素的離子化效率存在較大差異，導(dǎo)致連續(xù)流進(jìn)樣的信號(hào)強(qiáng)度變化范圍極大[1,3,6]。

以往技術(shù)人員通過嚴(yán)格控制取樣量，基于氦氣(He)進(jìn)行固定比例的稀釋，從而使樣品氣與參考?xì)庑盘?hào)保持一致[5]。但是，該方法耗時(shí)、費(fèi)力，有時(shí)甚至需要準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)樣品的元素含量。具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)[7-8]可以將測(cè)試序列的每個(gè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度通過He稀釋至參考?xì)庑盘?hào)水平[7]。對(duì)于同一測(cè)試序列中C/N差異較大的樣品，以及難以精確稱重的粘稠狀樣品(如蜂蜜、動(dòng)物脂肪等)，該系統(tǒng)無需精確控制樣品質(zhì)量，可直接裝樣上機(jī)，大大提高了樣品的分析效率[8]。

可以預(yù)見，在δ13C和δ15N的測(cè)定上，具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS有一定的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景[8]。然而，目前有關(guān)該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)在樣品測(cè)量中的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性考察還未見報(bào)道。本工作擬從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：1) 評(píng)價(jià)具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS與以往具有固定比例稀釋功能的EA-IRMS測(cè)定結(jié)果的一致性；2) 探討具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對(duì)不同類型樣品δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性；3) 評(píng)價(jià)該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)在不同測(cè)量時(shí)間上的再現(xiàn)性。希望為EA-IRMS技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器介紹

EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)主要由Flash 2000HT元素分析單元、ConFlo Ⅳ連續(xù)流接口裝置和DELTA ⅤAdvantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品)三部分組成。

Flash 2000 HT安裝了快速燃燒反應(yīng)器和高溫轉(zhuǎn)化反應(yīng)器[9]。其中，燃燒反應(yīng)器將樣品在高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，經(jīng)銅(Cu)還原形成CO2、N2等氣體。然后通過除鹵、除硫劑(Ag2Co3O4)和干燥劑(Mg(ClO4)2)吸附燃燒產(chǎn)生的鹵素、SO2和H2O等氣體。純化的CO2和N2氣體經(jīng)恒溫氣相色譜柱分離后進(jìn)入ConFlo Ⅳ，并由氦氣進(jìn)行固定比例的稀釋。Flash 2000 HT還配有Smart EA動(dòng)態(tài)稀釋組件，控制He流量對(duì)進(jìn)入ConFloⅣ的樣品氣進(jìn)行不同比例的稀釋[7]，主要參數(shù)設(shè)定列于表1。

表1 Flash 2000 HT元素分析儀的參數(shù)設(shè)定Table 1 Parameters of Flash 2000 HT Elemental Analyzer

ConFlo Ⅳ是具有自動(dòng)稀釋功能的連續(xù)流通用接口，采用高純CO2(99.995%)和N2(99.999%)作為參考?xì)猓⒂筛呒僅e(99.999%)稀釋和運(yùn)載。通過內(nèi)置的開口分流器將參考?xì)夂蜆悠窔庖隓ELTA V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀中，在樣品N2出峰之前、樣品CO2出峰之后分別引入?yún)⒖細(xì)狻?/p>

DELTA V Advantage是具有3 kV加速電壓的氣體穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，在1.6×10-4Pa超高真空條件下，該儀器采集CO2氣體電離后產(chǎn)生的[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+分子離子束，或N2氣體電離后產(chǎn)生的[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+分子離子束，經(jīng)不同電阻值的放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)后完成δ13C和δ15N的檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

為了評(píng)價(jià)不同稀釋方法對(duì)δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果的影響，分別采用不稀釋(0)、固定比例稀釋(57%)和動(dòng)態(tài)稀釋(0～96%)的EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜、土壤及咖啡因進(jìn)行測(cè)定。這些樣品的C和N元素含量分別為0.24%～79%和0.078%～29.5%，其中，土壤樣品中C和N含量極低，所以取樣量較大。不稀釋時(shí)，上述8種樣品取樣量依次為(0.260±0.075)、(0.226±0.093)、(0.181±0.070)、(0.232±0.070)、(0.172±0.026)、(0.274±0.032)、(15.531±1.843)和(0.205±0.052) mg(n=3)；固定比例稀釋時(shí)，取樣量依次為(0.603±0.065)、(0.648±0.016)、(0.647±0.032)、(0.566±0.029)、(0.486±0.063)、(0.559±0.084)、(29.848±2.310)和(0.515±0.083) mg(n=3)；動(dòng)態(tài)稀釋時(shí)，取樣量依次為(0.400±0.191)、(0.504±0.138)、(0.343±0.142)、(0.394±0.184)、(0.480±0.149)、(0.448±0.087)、(42.329±10.209)和(0.377±0.076) mg(n=3)。

為實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)稀釋，需建立EA-IRMS中熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)與質(zhì)譜檢測(cè)器(MSD)信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)關(guān)系。具體方法是：稱取不同質(zhì)量純尿素，得到TCD與MSD信號(hào)強(qiáng)度(ITCD和IMSD)之間的線性關(guān)系，即CO2：IMSD=1.4774×ITCD-834.49(r2=0.999 9)和N2：IMSD=1.042 6×ITCD-657.81(r2=0.999 8)；再將后續(xù)每個(gè)樣品的TCD信號(hào)代入上述方程得到原始的MSD信號(hào)，通過Isodat 3.0軟件計(jì)算稀釋比例[7]，將該MSD信號(hào)稀釋至參考?xì)庑盘?hào)水平(m/z44：6 V；m/z28：1.5 V)。動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS測(cè)定δ13C和δ15N的結(jié)果譜圖示于圖1。

注：1～3為N2參比峰；4為N2樣品峰；5為CO2樣品峰；6～8為CO2參比峰；9和10分別為TCD檢出的N2和CO2樣品峰圖1 動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS的質(zhì)譜檢測(cè)器MSD(a)和熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD(b)測(cè)定δ13C和δ15N的色譜圖Fig.1 Chromatograms of δ13C and δ15N measured by MSD (a) and TCD (b) detectors of EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

為探討具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對(duì)不同類型樣品δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性，在同一個(gè)測(cè)試序列中對(duì)9種不同類型樣品(蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜、蘋果、土壤及咖啡因)進(jìn)行測(cè)定。各平行樣品之間設(shè)置一定的質(zhì)量梯度，取樣量依次為0.278～0.621、0.354～1.318、0.220～1.820、0.237～2.029、0.461～0.638、0.358～3.545、1.739～6.249、16.350～32.687和0.299～0.451 mg(n=3)。

為評(píng)價(jià)具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同測(cè)量時(shí)間上的再現(xiàn)性，分別于2016年3月4日和4月19日采用該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)上述蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜和土壤樣品的δ13C和δ15N進(jìn)行分析。2次測(cè)定中，樣品取樣量與上述的δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果重復(fù)性測(cè)試接近。

1.3 數(shù)據(jù)分析

碳和氮的穩(wěn)定同位素組成采用相對(duì)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(VPDB和AirN2)的千分差/‰，用符號(hào)δ表示，本文統(tǒng)一簡(jiǎn)寫成δ13C和δ15N。所有被測(cè)樣品δ13C和δ15N均采取兩點(diǎn)線性內(nèi)插法[4]進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，即采用2個(gè)不同δ13C和δ15N的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立其真值與測(cè)量值之間的線性方程，將被測(cè)樣品的測(cè)量值代入該方程后得到標(biāo)準(zhǔn)化的δ13C和δ15N。本研究的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別為USGS40和USGS41，其化學(xué)成分均為L(zhǎng)-谷氨酸，δ13C真值分別為-26.39‰和37.63‰，δ15N真值分別為-4.52‰和47.57‰。不同稀釋方法(不稀釋、固定比例稀釋和動(dòng)態(tài)稀釋)對(duì)δ13C和δ15N測(cè)量結(jié)果的影響，以及具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同時(shí)間對(duì)δ13C和δ15N測(cè)量結(jié)果的差異性均采用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同稀釋方法下δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果的一致性

不稀釋(0)、固定比例稀釋(57%)和動(dòng)態(tài)稀釋(0～96%)下，不同類型樣品δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果示于圖2。動(dòng)態(tài)稀釋與固定比例稀釋、不稀釋相比，δ13C平均偏差分別為(-0.14±0.22)‰和(0.05±0.18)‰。動(dòng)態(tài)稀釋與不稀釋相比，δ15N平均偏差為(0.02±0.24)‰。3種稀釋方法的δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果不存在顯著差異(p>0.05)。大部分樣品在不稀釋或稀釋后的MSD信號(hào)強(qiáng)度均大于1 V，受空白效應(yīng)影響較??；δ13C和δ15N不存在顯著非線性問題[10-11]，這可能是不同稀釋方法的測(cè)定結(jié)果較一致的重要原因。δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果表明，具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS能夠滿足實(shí)驗(yàn)室測(cè)試要求[12-13]。尤其當(dāng)不同樣品之間C、N元素含量及C/N差異很大或者難以精確稱重時(shí)，動(dòng)態(tài)稀釋法更加實(shí)用且高效[8]。

圖2 不稀釋、固定比例稀釋與動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS測(cè)定δ13C(a)和δ15N(b)結(jié)果的一致性Fig.2 Consistency ofδ13C (a) and δ15N (b) measurement results by different dilution methods

2.2 動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS對(duì)不同樣品δ13C和δ15N測(cè)定的重復(fù)性

具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對(duì)不同樣品δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果列于表2。被測(cè)樣品的C、N元素含量(0.2%～78.8%和0.077%～29.7%)及C/N(1.68～219)的變化范圍均較大，且每種樣品的3組平行取樣量變化較大，同一樣品最大與最小取樣量的比例最高接近10倍。動(dòng)態(tài)稀釋過程中，通過He將CO2或N2樣品氣進(jìn)行了全動(dòng)態(tài)稀釋，使CO2或N2樣品氣與相應(yīng)參考?xì)獾男盘?hào)強(qiáng)度(m/z44：6 V或m/z28：1.5 V)始終保持一致。結(jié)果表明，被測(cè)樣品δ13C和δ15N變化分別為-27.9‰～-13.9‰和-0.9‰～8.5‰，測(cè)定精度分別為0.07‰～0.32‰和0.05‰～0.27‰，滿足EA-IRMS測(cè)試要求[12-13]。該結(jié)果進(jìn)一步表明，具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS能夠測(cè)定同一測(cè)試序列內(nèi)具有不同質(zhì)量及C/N的樣品。該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)可以為提高δ13C和δ15N的分析效率提供強(qiáng)有力的工具[8]。

表2 動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS對(duì)不同類型樣品δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果Table 2 δ13C and δ15N measurement results of different types of samples by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

續(xù)表2

注：δ13C和δ15N采用平均值±1SD/‰表示

圖3 動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS在不同時(shí)間測(cè)定δ13C(a)和δ15N(b)結(jié)果的一致性Fig.3 Consistency of δ13C (a) and δ15N (b) measurement results by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component at different time

2.3 動(dòng)態(tài)稀釋EA-IRMS在不同測(cè)量時(shí)間上的再現(xiàn)性

具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同時(shí)間的δ13C和δ15N測(cè)定結(jié)果示于圖3。2次測(cè)定(間隔45天)中，δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果不存在顯著差異(p>0.05)，表明該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果再現(xiàn)性良好。同一樣品中，δ13C和δ15N的2次測(cè)定結(jié)果的平均偏差分別為(-0.05±0.35)‰和(0.16±0.37)‰，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室測(cè)試要求[12-13]。需要指出的是，土壤δ13C、豬肉脂肪δ13C和菠菜δ15N在不同時(shí)間的測(cè)定偏差均超過了±0.3‰。這可能由于上述樣品在較長(zhǎng)的貯存時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了同位素分餾效應(yīng)[14-16]。另外，樣品均勻性較差和測(cè)定次數(shù)較少也可能導(dǎo)致較大的測(cè)定偏差。因此，建議在今后的研究中縮短樣品分析周期，均勻研磨與取樣，適當(dāng)增加平行實(shí)驗(yàn)，以提高δ13C和δ15N的測(cè)定準(zhǔn)確性[15,17-19]。

3 結(jié)論

本研究采用具有動(dòng)態(tài)稀釋功能的EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)，快速測(cè)定了不同類型的固體和粘稠樣品的δ13C和δ15N，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)固定比例稀釋、不稀釋法相比具有較好的一致性，3種稀釋法測(cè)定結(jié)果的平均偏差為±0.15‰，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室測(cè)試要求。通過測(cè)定具有不同C、N含量和C/N比值的9種樣品，結(jié)果表明，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)δ13C和δ15N的測(cè)定結(jié)果具有良好的重復(fù)性。利用He對(duì)樣品氣進(jìn)行全動(dòng)態(tài)稀釋，可使樣品氣與參考?xì)獾男盘?hào)強(qiáng)度保持在相等水平，δ13C和δ15N的平均精度均優(yōu)于0.2‰。此外，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)在不同測(cè)量時(shí)間(間隔45天)具有較好的再現(xiàn)性，大部分樣品δ13C和δ15N的2次測(cè)定結(jié)果偏差分別小于0.2‰和0.3‰。該研究結(jié)果對(duì)提高EA-IRMS的δ13C和δ15N測(cè)定效率具有借鑒意義。