張小平，鐘達(dá)財(cái)，劉建川，熊劍亮，陳煥文

(1.東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191)

電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)與電噴霧萃取電離質(zhì)譜(EESI-MS)技術(shù)都可用于小分子、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等的檢測(cè)，在化學(xué)、生物、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-5]。ESI與EESI均屬于軟電離技術(shù)，二者的工作原理與分析性能既有區(qū)別也有聯(lián)系。在ESI中，高壓電場(chǎng)直接施加在流過(guò)較窄毛細(xì)管(內(nèi)徑100 μm)的分析樣品溶液中，待測(cè)物直接暴露在高強(qiáng)電場(chǎng)(如，3 kV/m)中，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間(如，10 s)作用后流出毛細(xì)管，并在電場(chǎng)及輔助氣作用下發(fā)生電離和霧化，產(chǎn)生的帶電液滴經(jīng)去溶等過(guò)程形成離子供后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)[6-8]。EESI與ESI顯著不同，樣品(一般都含有復(fù)雜基體)在電中性(即無(wú)電場(chǎng)作用)的條件下被氣動(dòng)霧化，形成微小液滴后再與由ESI產(chǎn)生的試劑液滴(甲醇-水)在敞開(kāi)的大體積(約200 mL)空間中交叉、碰撞、融合，伴隨著敞開(kāi)環(huán)境中的液-液微萃取過(guò)程(約50 ms)，在三維空間內(nèi)完成能荷傳遞作用，形成目標(biāo)分子離子[3,5]。值得注意的是，EESI過(guò)程中，待測(cè)物分子或離子始終沒(méi)有與強(qiáng)電場(chǎng)直接接觸，而是通過(guò)沐浴在由ESI產(chǎn)生的帶電液滴組成的“電荷雨”中獲得電荷，繼而經(jīng)去溶等過(guò)程形成離子供后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)。顯然，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，EESI過(guò)程傳遞給目標(biāo)離子的能量比ESI低。研究表明，EESI能夠保持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性[9]，而ESI條件下的蛋白經(jīng)過(guò)電離的影響喪失了大部分生物活性[4]。這表明EESI比ESI更溫和，且EESI與ESI在性能方面(提供給母離子的內(nèi)能等)存在顯著差異，但二者之間的具體內(nèi)能差異尚不清楚。迄今為止，未見(jiàn)采用質(zhì)譜儀對(duì)這兩種離子源所產(chǎn)生的離子內(nèi)能差異進(jìn)行測(cè)定的方法報(bào)道。因此，有必要建立ESI與EESI內(nèi)能差異的測(cè)量方法。

離子自生成后即處于激發(fā)態(tài)，具有一定的內(nèi)能，碎片離子形成與否[10]、母離子不同的碎裂方式[11]均由母離子的內(nèi)能大小決定。離子最初的內(nèi)能來(lái)自離子源，不同類型的離子源賦予同一種離子的能量不同，導(dǎo)致生成離子的內(nèi)能存在差異。比如，電子轟擊電離源具有的能量高達(dá)70 eV，直接作用在樣品分子上會(huì)產(chǎn)生具有高內(nèi)能的自由基陽(yáng)離子，剩余的能量進(jìn)一步使其裂解產(chǎn)生碎片離子。采用溫和的軟電離源，產(chǎn)生的碎片離子較少，但可通過(guò)改變離子源的參數(shù)來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生碎片離子。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道離子源中離子內(nèi)能的測(cè)定方法，比如溫度計(jì)離子法[12]、去卷積法[13]、離子生存率法[14-15]等。溫度計(jì)離子法可用來(lái)估算儲(chǔ)存在母離子中的內(nèi)能分布，主要用于在熱力學(xué)方面表征離子的連續(xù)碎裂過(guò)程。去卷積法是一種確定離子內(nèi)部能量的方法。離子生存率法是將分子的碎裂程度與內(nèi)能相關(guān)聯(lián)，主要應(yīng)用在軟電離中，該方法基于兩個(gè)假設(shè)，即具有相同自由度的離子其內(nèi)能分布相似，離子的內(nèi)能在低于離子本身的解離閾值時(shí)不會(huì)發(fā)生碎裂[11]。然而，這些方法大多采用源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)技術(shù)，通過(guò)調(diào)節(jié)離子傳輸過(guò)程中的加速電壓(錐孔電壓)來(lái)計(jì)算離子內(nèi)能的分布。采用源內(nèi)CID技術(shù)的不足之處在于缺少母離子的選擇富集過(guò)程，電離過(guò)程中產(chǎn)生的所有離子都會(huì)被碰撞活化，而且由于源內(nèi)CID的能量比CID的能量要低些，導(dǎo)致碎裂的時(shí)間尺度延長(zhǎng)，直接的碎裂解離速率小，因此，易發(fā)生重排反應(yīng)，最終測(cè)定的平均內(nèi)能值往往比高能量CID技術(shù)測(cè)定的平均內(nèi)能值更低[11]。同時(shí)，離子生存率法沒(méi)有考慮動(dòng)力學(xué)位移[15]，通常需要獲得比臨界能更高的內(nèi)能才能得到碎片離子，采用該方法測(cè)定的平均內(nèi)能分布值往往比實(shí)際值偏小[11]。而CID技術(shù)可以對(duì)母離子進(jìn)行選擇、活化等，避免了其他離子的干擾。因此，該技術(shù)適用于分析不同離子源的內(nèi)能差異。

本工作擬采用EESI-MS和ESI-MS對(duì)羅丹明B的裂解行為差異進(jìn)行比較研究，通過(guò)考察不同碰撞能量對(duì)裂解行為的影響，建立EESI和ESI兩種離子源一價(jià)正離子內(nèi)能差異的測(cè)定方法，并對(duì)EESI和ESI的內(nèi)能差異進(jìn)行定量測(cè)定，希望為理解不同離子源產(chǎn)生離子的質(zhì)譜行為提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

EESI和ESI離子源：均由本實(shí)驗(yàn)室自行研制搭建；LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀：配有Xcalibur型數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)Finnigan公司產(chǎn)品；N2、Ar：純度>99.999%，均為江西國(guó)騰氣體有限公司產(chǎn)品；羅丹明B：百靈威(上海)公司產(chǎn)品。

1.2 質(zhì)譜條件

EESI-MS/MS：線性離子阱質(zhì)譜(LTQ-MS)，正離子檢測(cè)模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～600。EESI使用的萃取劑為水，萃取劑和樣品溶液的流速均為1 μL/min；噴霧電壓4.0 kV；噴霧氣壓1.0 MPa(N2，純度>99.999%)；兩噴霧通道之間的角度β為60°，兩噴霧口間距b為2 mm；噴霧口至質(zhì)譜口的距離a為10 mm，角度α為150°；毛細(xì)管溫度150 ℃；毛細(xì)管錐孔電壓10 V；透鏡電壓30 V。整個(gè)質(zhì)譜儀真空系統(tǒng)主要由三級(jí)差分抽氣真空組成：前級(jí)真空度172.9 Pa，二級(jí)真空度0.133 Pa，離子阱(三級(jí))真空度為1.33×10-3Pa。在進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)，離子的最大進(jìn)入時(shí)間為300 ms；母離子的隔離窗口寬度設(shè)定為m/z1.0；活化值Q為0.25；碰撞活化時(shí)間為30 ms；離子的冷卻時(shí)間為6 ms；碰撞氣體為氬氣(純度>99.999%)；碰撞能量為0%～100%。其他參數(shù)由LTQ-Tune軟件系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化，使m/z443離子(質(zhì)子化羅丹明B)的信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最佳。

ESI-MS/MS：線性離子阱質(zhì)譜(LTQ-MS)，正離子檢測(cè)模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～600。ESI使用的溶劑為水；樣品溶液流速為1 μL/min；其他參數(shù)同EESI-MS/MS方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定EESI與ESI內(nèi)能差異的基本原理

樣品溶液電離后形成離子，在毛細(xì)管傳輸作用下進(jìn)入離子阱。從離子源引入離子阱時(shí)，離子一般具有較大的動(dòng)能，這些高能量的離子必須與碰撞氣體分子發(fā)生碰撞，實(shí)現(xiàn)離子動(dòng)能的碰撞轉(zhuǎn)移(冷卻)，從而被束縛在離子阱的中心[16]。在串聯(lián)質(zhì)譜分析過(guò)程中，被電場(chǎng)加速的高能離子必須與碰撞氣體分子發(fā)生碰撞才可以將離子的動(dòng)能轉(zhuǎn)化為離子內(nèi)部的能量，高內(nèi)能的離子進(jìn)一步發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂生成碎片離子。因此，離子的內(nèi)能來(lái)源主要包括離子化過(guò)程的能量、離子傳輸過(guò)程的能量和離子阱中的碰撞能量3部分。

ESI源的噴針一般設(shè)置在高電壓，而離子入口設(shè)置在低電壓。即在ESI過(guò)程中，樣品溶液會(huì)在高電場(chǎng)下被加速，形成獲得動(dòng)能的離子，這些高動(dòng)能的離子與周圍的氣體分子發(fā)生碰撞，將動(dòng)能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能。而在EESI中，目標(biāo)離子產(chǎn)生后進(jìn)入的加速電場(chǎng)比ESI中的加速電場(chǎng)弱，所以其動(dòng)能和轉(zhuǎn)化的內(nèi)能較小。ESI與EESI產(chǎn)生的離子進(jìn)入毛細(xì)管后，由于不存在加速電場(chǎng)，它們將與毛細(xì)管中處于“室溫”下的中性氣體發(fā)生碰撞。碰撞過(guò)程中，離子的內(nèi)能會(huì)增加，同時(shí)高能量的離子會(huì)將能量傳遞給中性氣體分子，如果碰撞足夠，最后離子會(huì)被“碰撞冷卻”至室溫。

理論上，同一物質(zhì)(保持濃度、溶劑等參數(shù)不變)在相同的傳輸條件下或相同的碰撞能量下獲得的能量相同。那么，如果保持傳輸條件與碰撞條件一致，離子化過(guò)程的能量差異即為離子所獲得的內(nèi)能差異。離子內(nèi)能變化直接體現(xiàn)為離子豐度行為的差異。為了測(cè)定兩種離子源的內(nèi)能差異，實(shí)驗(yàn)研究了串聯(lián)質(zhì)譜中不同碰撞能量條件下兩種離子源時(shí)羅丹明B的質(zhì)譜裂解行為差異?？筛鶕?jù)下面的計(jì)算方法快速地測(cè)定兩種離子源的內(nèi)能差異。

現(xiàn)定義Eion為母離子獲得的總內(nèi)能，Esou為離子源給母離子提供的內(nèi)能，Etran為樣品電離后母離子在離子傳輸過(guò)程中獲得的內(nèi)能，Ecol為母離子在CID過(guò)程中獲得的能量，可得到式(1)。

Eion=Esou+Etran+Ecol

(1)

如果碰撞能量和傳輸過(guò)程的條件均保持一致，改變不同的電離源，則母離子在不同離子源中獲得的總內(nèi)能不同，它們之間的內(nèi)能差異即為兩個(gè)離子源給母離子提供內(nèi)能的差異，列于式(2)。

(2)

(3)

結(jié)合式(2)和式(3)可得到式(4)。

(4)

廠商提供的碰撞能量與歸一化碰撞能量之間的換算關(guān)系列于式(5)。

Eion=(settling NCE)×(isolation center)×

(charge factor)÷(500m/z)

(5)

其中，settling NCE為CE的設(shè)置值；isolation center為母離子的質(zhì)荷比；charge factor為電荷因子，如果帶單電荷，則取值為1。假設(shè)母離子為m/z500，那么當(dāng)NCE設(shè)置值為20時(shí)，對(duì)應(yīng)的能量是20×500/500×1=20 eV。

結(jié)合式(4)、(5)可得到式(6)。

ΔEion=(NCE2-NCE1)×(isolation center)×

(charge factor)÷500

(6)

2.2 羅丹明B的EESI-MS和ESI-MS分析

本實(shí)驗(yàn)分別搭建EESI-MS和ESI-MS裝置平臺(tái)，通過(guò)調(diào)控CID能量，對(duì)羅丹明B進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。當(dāng)碰撞能量為30%時(shí)，母離子m/z443主要丟失C2H4、C2H6和CO2中性分子，分別產(chǎn)生m/z415、m/z413和m/z399碎片離子。羅丹明B的EESI-MS2圖和ESI-MS2圖示于圖1。對(duì)比圖1a、1b可以發(fā)現(xiàn)，兩種方法獲得的碎片離子是一致的，但在ESI-MS中，碎片離子的相對(duì)豐度明顯較EESI-MS中高，說(shuō)明采用ESI對(duì)羅丹明B進(jìn)行電離，準(zhǔn)分子離子峰m/z443碎裂得更徹底，從而證明了EESI是一種比ESI更“軟”的電離方式[17]。保持離子化條件和離子傳輸條件一致，僅改變離子阱中的碰撞能量，碎片離子峰強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生明顯差異[18]。Shevchenko等[19]分別采用高能碰撞解離(HCD)和CID模式對(duì)磷脂類物質(zhì)的裂解行為進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在離子阱中HCD模式下比CID模式下產(chǎn)生的碎片離子豐度更強(qiáng)，這是由于HCD具有更高的能量，可進(jìn)一步促使母離子裂解形成豐度更高的碎片離子。而在本實(shí)驗(yàn)中，采用ESI和EESI兩種不同的電離方式，使離子傳輸條件與離子阱碰撞條件保持一致，得到的碎片離子豐度差異明顯。兩者譜圖的差異是由于EESI與ESI傳遞給目標(biāo)分子的內(nèi)能存在差異。

注：a.EESI-MS2圖；b.ESI-MS2圖圖1 碰撞能量為30%，羅丹明B的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 Tandem MS spectra of rhodamine B at the normalized collision energy of 30%

2.3 EESI與ESI傳遞給母離子內(nèi)能差異的比較

在串聯(lián)質(zhì)譜中，增大碰撞能量能夠加大母離子的碎裂程度。為了比較EESI與ESI之間能量的差異，在不同碰撞能量條件下對(duì)羅丹明B進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，其母離子和碎片離子的峰強(qiáng)度與碰撞能量之間的關(guān)系示于圖2a?？梢钥闯?，EESI-MS2與ESI-MS2中母離子與對(duì)應(yīng)碎片離子隨能量的變化趨勢(shì)基本一致，但變化的幅度(斜率)、對(duì)應(yīng)碎片離子的豐度行為差異較大。隨著碰撞能量的升高，碎片離子的豐度逐漸增加，當(dāng)碰撞能量過(guò)高時(shí)(>30%)，碎片離子無(wú)法在阱中穩(wěn)定存在，導(dǎo)致碎片離子強(qiáng)度開(kāi)始降低。通過(guò)擬合各曲線，得到ESI-MS2中碰撞能量在20%～40%之間時(shí)，母離子m/z443變化的斜率值(即對(duì)應(yīng)能量增加的靈敏度)約為3 512；碰撞能量在20%～30%之間時(shí)，碎片離子m/z413變化的斜率值約為3 255，交點(diǎn)處的質(zhì)譜圖示于圖1a。兩者的斜率值相差不大，說(shuō)明m/z443下降的斜率主要是生成m/z413。在EESI-MS2中，碰撞能量在15%～35%之間時(shí)，母離子m/z443變化的斜率值約為1 514；碰撞能量在15%～30%之間時(shí)，碎片離子m/z413變化的斜率值約為73，即m/z443下降的斜率較少部分是用來(lái)產(chǎn)生m/z413的。

母離子經(jīng)過(guò)碰撞活化后，會(huì)發(fā)生分子內(nèi)振動(dòng)能量重新分布的現(xiàn)象，而且能量重排優(yōu)于斷裂反應(yīng)。如果只考慮單鍵，則振動(dòng)激發(fā)引起的斷裂總是發(fā)生在能量最低的化學(xué)鍵，這使基于振動(dòng)激發(fā)模型下的各種技術(shù)所產(chǎn)生碎片的形式僅依賴于母離子吸收能量的多少，而與能量接收方式無(wú)關(guān)[20]。這表明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，在ESI-MS中有更多的能量作用在母離子上，驅(qū)使母離子碎裂形成更高強(qiáng)度的碎片離子。而引起這種現(xiàn)象的根源在于ESI與EESI離子源之間的內(nèi)能存在一定的差異，這種差異直接表現(xiàn)在碎片離子的豐度變化上。

碎片離子與母離子峰強(qiáng)度比值同碰撞能量之間的關(guān)系示于圖2b?？梢钥闯觯贓ESI-MS2與ESI-MS2中，碎片離子與母離子峰強(qiáng)度比值隨能量的變化趨勢(shì)基本一致。在低碰撞能量(20%～30%)條件下，碎片離子與母離子峰強(qiáng)度比值緩慢上升；在高碰撞能量(30%～45%)條件下，碎片離子與母離子峰強(qiáng)度比值呈指數(shù)上升，母離子基本完全裂解，碎片離子強(qiáng)度快速升高。這是由于高碰撞能量使分子瞬間活化，加速了碎裂速率；而且在高能量碰撞條件下，離子運(yùn)動(dòng)劇烈，碎片離子無(wú)法在阱中穩(wěn)定存在，導(dǎo)致部分離子排至阱外，或者繼續(xù)分解成更小的碎片離子等，使其對(duì)ESI和EESI離子源內(nèi)能差異的影響減弱。因此，高碰撞能量條件并不適用于計(jì)算離子源的內(nèi)能差異。

注：a.m/z 413、m/z 415和m/z 443的強(qiáng)度與碰撞能量的關(guān)系；b.子離子與母離子強(qiáng)度的比值與碰撞能量的關(guān)系圖2 在ESI-MS2和EESI-MS2條件下，離子強(qiáng)度的變化與碰撞能量的關(guān)系圖Fig.2 Variation of ion intensities as a function of collision energy by ESI-MS2 and EESI-MS2

以碎片離子m/z413為例，采用2.1節(jié)方法計(jì)算兩種離子源的內(nèi)能差異。低碰撞能量(1%～21%)條件下，ESI-MS2和EESI-MS2中碎片離子m/z413絕對(duì)強(qiáng)度的變化趨勢(shì)示于圖3。在ESI-MS2中，當(dāng)碰撞能量為1%時(shí)，碎片離子m/z413的強(qiáng)度為1，隨著碰撞能量持續(xù)增大，m/z413的強(qiáng)度緩慢增加，當(dāng)能量為13%時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，隨后m/z413的強(qiáng)度呈指數(shù)快速增加，示于圖3a。這可能是由于羅丹明B分子中的共軛體系很大，且具有剛性平面結(jié)構(gòu)，低碰撞能量過(guò)程中傳遞給羅丹明B分子的能量大部分用于降低分子共軛體系的能量，小部分用來(lái)解離形成碎片，當(dāng)碰撞能量增大到一定值(遠(yuǎn)大于分子的鍵解離能)時(shí)，碎片離子的強(qiáng)度顯著增加，此時(shí)的能量主要用于形成碎片離子。在EESI-MS2中，當(dāng)碰撞能量小于14%時(shí)，羅丹明B分子未被活化，碎片離子m/z413的強(qiáng)度均為0，要使碎片離子m/z413的峰強(qiáng)度達(dá)到1，碰撞能量至少為14%，即使ESI-MS2和EESI-MS2中碎片離子m/z413的強(qiáng)度相同(均為1)，兩者串聯(lián)質(zhì)譜中的碰撞能量之差為13%。結(jié)合2.1節(jié)的計(jì)算式可知，13%的碰撞能量即為兩種離子源的內(nèi)能差。由式(6)可計(jì)算出兩種離子源的內(nèi)能差值為11.5 eV。

注：a.ESI-MS2；b.EESI-MS2圖3 m/z 413的強(qiáng)度與碰撞能量從1%～21%變化的關(guān)系圖Fig.3 Variation of m/z 413 intensities as a function of collision energy of 1%-21%

2.4 方法的適用性

為了提高該方法測(cè)量的準(zhǔn)確性，選擇其他碎片離子(如m/z415、m/z399等)來(lái)測(cè)定內(nèi)能差異。在ESI-MS2中，當(dāng)碰撞能量為1%時(shí)，碎片離子m/z415的強(qiáng)度為0.4；在EESI-MS2中，要使碎片離子m/z415的峰強(qiáng)度達(dá)到0.4，碰撞能量至少為14%，即兩種離子源的內(nèi)能差為13%的碰撞能量。由式(6)計(jì)算兩種電離源內(nèi)能差值為11.5 eV。采用該方法對(duì)碎片離子m/z399的強(qiáng)度變化進(jìn)行計(jì)算，得到的結(jié)果與上述一致，由此驗(yàn)證了該方法計(jì)算內(nèi)能差異的可靠性。

3 結(jié)論

本研究采用質(zhì)譜中離子豐度行為差異對(duì)EESI和ESI兩種軟電離技術(shù)的內(nèi)能差異進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，其測(cè)定值為11.5 eV。該方法原理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需繁雜的計(jì)算過(guò)程，不僅可為不同離子源內(nèi)能差異的比較提供參考依據(jù)，也可為深刻理解不同離子源產(chǎn)生離子的質(zhì)譜行為提供參考。