周 慧，王義民，鄭 重，劉 舒，劉志強

(1.吉林大學珠海學院，廣東 珠海 519041；2.中國科學院長春應(yīng)用化學研究所，吉林 長春 130022)

中藥活性成分篩選研究是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分，也是實現(xiàn)中藥“走出去”的必經(jīng)之路。較之傳統(tǒng)的人工合成藥物設(shè)計模式，中藥化學成分的多樣性使其在新藥研發(fā)方面體現(xiàn)出較大優(yōu)勢。從中藥成分中篩選得到的活性物質(zhì)往往結(jié)構(gòu)新穎、療效高、不良反應(yīng)少，既可以直接開發(fā)為新藥，也可以作為先導化合物進行結(jié)構(gòu)修飾與優(yōu)化后成為一代新藥[1]，現(xiàn)已成為制藥工業(yè)中新藥研發(fā)的來源之一。根據(jù)文獻[2]報道，在過去30多年時間里，超過50%已批準上市的藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物。因此，以中藥為來源的藥物活性成分篩選受到新藥研發(fā)工作者的推崇。

傳統(tǒng)的中藥活性成分篩選模式主要以多次提取、分離為基礎(chǔ)，其基本思路是利用體外藥效評估對提取分離的每一階段組分進行活性評價，追蹤其活性組分，然后繼續(xù)追蹤活性顯著組分，直至獲得活性單體成分。但這種研究策略往往實驗周期長、工作量大，無法實現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，而且該篩選模式忽略了中藥多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，導致篩選出的一些藥物藥用效果較差[3]。因此，基于疾病靶點的、以活性為導向的高通量篩選研究十分必要。

近年來，隨著“精準醫(yī)療”計劃的提出，傳統(tǒng)的藥物研究模式已經(jīng)轉(zhuǎn)向了“精準”靶向藥物分子設(shè)計策略[4-5]。以靶標-配體精確相互作用為理論基礎(chǔ)，通過藥物活性成分與疾病相關(guān)的特定生物靶點相互作用，發(fā)現(xiàn)對靶蛋白具有親和力、特異性強的小分子配體。親和超濾質(zhì)譜(affinity ultrafiltration mass spectrometry, AUF-MS)篩選技術(shù)符合精準醫(yī)療時代下靶向藥物研究的需求，其利用小分子藥物配體和靶標之間特異性結(jié)合的特性，將具有潛在活性的小分子化合物的混合物與靶標蛋白混合，得到靶標-配體復合物和未結(jié)合的小分子，通過超濾裝置將未結(jié)合的小分子濾除后，將靶標-配體復合物解離，釋放出與靶標蛋白結(jié)合的活性成分，再利用液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)分析活性化合物[6]。該技術(shù)可針對特定的疾病靶標進行全面、客觀的篩選，獲得的天然配體具有藥理活性顯著、靶向清晰、機制明確等特點，可作為新藥研發(fā)中具有臨床開發(fā)價值的候選化合物。由于利用該方法進行篩選時，可洗掉大量無活性的化合物，加快了活性化合物的解析速度[7-8]。

特別是隨著HPLC-MS技術(shù)在分子質(zhì)量檢測范圍、靈敏度等方面性能的提高，使得親和超濾質(zhì)譜技術(shù)從復雜中藥體系中篩選和鑒定活性成分的優(yōu)勢更加明顯。

本工作將從親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的原理、特點、應(yīng)用進展等方面進行綜述。

1 親和超濾質(zhì)譜概述

1.1 基本原理和分類

親和超濾是利用已知靶蛋白(受體)與未知體系小分子(配體)特異性地結(jié)合，通過超濾膜對不同大小物質(zhì)選擇性的差異實現(xiàn)活性物質(zhì)的快速分離和篩選。具體操作為：首先，將待篩選體系與選定的靶蛋白進行孵育，使得有親和活性的小分子與靶蛋白活性位點特異性結(jié)合形成受體-配體復合物，沒有親和活性的化合物則游離出來[9]。然后，利用超濾膜的選擇透過性，用緩沖液將未與靶蛋白結(jié)合的化合物洗脫下來，將超濾膜截留下來的復合物用一定比例的有機溶劑處理，或者改變體系的pH值使受體蛋白變性，釋放出小分子配體。最后，利用HPLC-MS技術(shù)快速分析和鑒定小分子活性物質(zhì)，其原理示于圖1。

親和超濾技術(shù)分為脈沖超濾和離心超濾[11]。兩者篩選小分子活性物質(zhì)的基本原理相同，均是通過半透膜的選擇特異性達到富集配體的目的[12-13]。脈沖超濾的操作單元由超濾室(分為上室和下室)、磁力攪拌器和超濾膜組成[14]，脈沖超濾室的兩室之間被超濾膜隔開。脈沖超濾的基本篩選過程為：將受體-配體的混合物置于超濾膜上，通過施加一定的壓力, 選擇與受體有一定親和能力的配體，再通過HPLC-MS法對選擇得到的配體進行結(jié)構(gòu)鑒定。在脈沖超濾中，可以根據(jù)受體-配體混合液體積選擇超濾室的大小，還可對超濾室進行控溫，以優(yōu)化受體-配體反應(yīng)溫度[15]。離心超濾則采用商品化的超濾離心管，通過離心篩選化合物，不需復雜的操作程序，且實驗的重現(xiàn)性良好。但是，較之脈沖超濾，離心超濾過程中往往存在濃差極化現(xiàn)象，導致超濾膜的過濾速度降低，嚴重的會導致蛋白在膜表面吸附和沉積，從而影響游離藥物的轉(zhuǎn)運。離心超濾與脈沖超濾的差異決定了它們的應(yīng)用范圍不同。離心超濾不能與質(zhì)譜在線聯(lián)用，主要用于小分子化合物的篩選，應(yīng)用范圍??；脈沖超濾可以實現(xiàn)與質(zhì)譜在線連接，適用于從組合化學庫和天然產(chǎn)物庫中篩選小分子物質(zhì)，尤其在計算靶標和配體的結(jié)合常數(shù)及藥物代謝研究方面優(yōu)勢明顯[15-16]。

圖1 超濾質(zhì)譜技術(shù)工作原理示意圖[10]Fig.1 Scheme of ultrafiltration mass spectrometry[10]

1.2 親和超濾質(zhì)譜的特點和優(yōu)勢

傳統(tǒng)的中藥成分活性物質(zhì)篩選研究模式通常是對中藥化學成分進行提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定，然后進行生物活性測定，確定有效成分。該分離篩選過程操作繁瑣、耗時長、對環(huán)境不友好，而且容易造成一些微量潛在活性物質(zhì)的丟失和大量假陽性結(jié)果的干擾[17]。相比之下，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在篩選活性物質(zhì)時具有操作簡單、效率高、成本低等特點。

首先，親和超濾所使用的靶分子用量少，且不需要經(jīng)過固定化處理，經(jīng)過有機溶劑處理和多次離心即可完成分離工作。這不僅簡化了實驗步驟，而且避免了蛋白受體經(jīng)固定化處理帶來的變性與失活。其次，由于蛋白受體和小分子配體是在天然溶液狀態(tài)下進行反應(yīng)的，不需要進行標記，因此能夠保持蛋白的天然構(gòu)象；同時，能夠控制受體和配體的孵育溫度，使其在接近生理條件下客觀地反映藥物小分子和生物大分子的相互作用。另外，超濾實驗所需要的靶標用量少，尤其對于價格昂貴的蛋白靶分子，實驗后經(jīng)處理可重復使用，節(jié)約了實驗成本。最后，通過超濾裝置與具有分離能力的色譜和具有結(jié)構(gòu)鑒定能力的質(zhì)譜聯(lián)用，使活性化合物的篩選、分離、鑒定(定性與定量)成為一個連續(xù)的過程，實現(xiàn)了高通量、高效率篩選。隨著更多類型質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，超濾質(zhì)譜將會更大程度地滿足不同藥物活性成分結(jié)構(gòu)鑒定的需要[18]。

1.3 影響親和超濾質(zhì)譜分析的關(guān)鍵因素

在超濾篩選實驗過程中，為了減少假陽性或假陰性結(jié)果的干擾，獲得理想的實驗數(shù)據(jù)，實驗設(shè)計時必須考慮以下因素：超濾膜的選擇、受體的使用劑量、解離液的選擇等。

1.3.1超濾膜的選擇 在親和超濾過程中，超濾膜的選擇決定著篩選結(jié)果的準確與否。選擇超濾膜一般需要遵循2個原則：1) 在選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)盡可能減少靶蛋白和配體與膜的非特異性吸附，目前應(yīng)用較多的材質(zhì)主要有再生纖維素、甲基纖維素、聚砜類、PEEK等。2) 根據(jù)分子截留量的大小選擇合適孔徑的超濾膜，膜的孔徑過小，容易造成膜的堵塞而產(chǎn)生高壓，影響膜的過濾效率；膜的孔徑過大，容易造成漏篩，同時降低了分子間的結(jié)構(gòu)強度，易導致膜的破裂[14,17]。根據(jù)以往的實驗經(jīng)驗，超濾膜的截留分子質(zhì)量應(yīng)該小于靶蛋白分子質(zhì)量的1/3，例如當靶分子分子質(zhì)量為25 ku時，可以選擇截留量為8 ku的超濾膜[17]。

1.3.2受體的使用劑量 實驗中受體的使用劑量會在一定程度上影響篩選結(jié)果。在反應(yīng)體系中，如果受體的濃度遠大于配體，則所有潛在的配體都會與受體結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；如果配體濃度遠大于受體，則只有結(jié)合能力強的配體才能與受體結(jié)合，從而導致結(jié)合力弱的潛在活性物質(zhì)被過濾掉，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。通常來說，確定受體的使用劑量時，應(yīng)盡量保證靶標與配體的濃度適中，且受體的濃度與結(jié)合能力最弱配體的Kd值近似相等[15]。

1.3.3解離液的選擇 在配體和受體完成特異性結(jié)合后，影響篩選結(jié)果的關(guān)鍵是如何成功地將配體從復合物中解離出來，并盡可能減少非特異性吸附。目前，配體的解離方法主要包括向溶液中加入一定比例的有機溶劑或者加入酸堿溶液以改變體系pH值，使蛋白變性失活，釋放出配體分子。

單一使用有機溶劑解離液可能會增加非特異性吸附，造成假陽性結(jié)果，而使用含酸的有機溶劑則能夠減少配體與超濾膜的非特異性結(jié)合。Nikolic等[19]考察了80%甲醇和10%甲醇+2%醋酸分別作為洗脫液時，乙嘧啶、甲氧芐氨嘧啶、雙嘧達莫這3種存在非特異性結(jié)合的物質(zhì)被洗脫下來的響應(yīng)信號強度，結(jié)果表明，使用10%甲醇+2%醋酸解離液比80%甲醇解離液獲得的假陽性信號明顯降低。本課題組Xu等[20]利用超濾技術(shù)從中藥復方二妙丸中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時發(fā)現(xiàn)，當選擇含酸的甲醇-水洗脫液時(50∶50，V/V，pH3.3)，對比實驗組和空白組的色譜圖，非特異性結(jié)合物質(zhì)的響應(yīng)信號較低。因此，在進行超濾篩選時，為了在一定程度上減少非特異性結(jié)合，最好選擇含酸的有機溶劑作為解離液。

1.3.4其他影響因素 對于離心超濾，除了以上3個重要因素外，靶蛋白與被篩選物質(zhì)的孵育時間、溫度、漂洗次數(shù)、離心轉(zhuǎn)速與次數(shù)等都會影響篩選結(jié)果。如果蛋白與被篩選樣品的孵育時間過短，相互作用不充分，容易造成漏篩；若孵育時間過長，兩者可能發(fā)生反應(yīng)，活性位點結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響結(jié)果準確性；孵育溫度的選取會影響蛋白酶的活性；離心轉(zhuǎn)速與次數(shù)的選取會影響蛋白與配體間的相互作用。親和超濾方法不能完全消除假陽性實驗結(jié)果，即不能完全避免配體與靶蛋白的非特異性結(jié)合。因此，在進行超濾實驗時，除了增加陰性對照組以減少假陽性結(jié)果外，還可在復合物解離前用緩沖液進行多次漂洗，以最大程度減少非特異性吸附。

2 親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

中藥作為大自然的分子寶庫，為藥物研發(fā)提供了豐富的化合物來源。目前，對于中藥活性物質(zhì)的研究主要以大規(guī)模提取分離為基礎(chǔ)。首先，通過多步分離、純化，獲得單體化合物；然后，通過核磁、質(zhì)譜等技術(shù)手段對其進行結(jié)構(gòu)確認；最后，使用經(jīng)典的動物、細胞模型進行生物學活性評價。這種研究策略往往實驗周期長、工作量大，無法實現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，而且難以分離和提純具有潛在活性的微量成分。親和超濾質(zhì)譜技術(shù)不但簡化了活性成分的分離、純化步驟，可使中藥活性成分的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定一步完成，而且能夠有效避免微量活性物質(zhì)的漏篩和雜質(zhì)干擾，可提高篩選結(jié)果的準確率，現(xiàn)已廣泛用于中藥活性成分研究。

本課題組運用親和超濾質(zhì)譜技術(shù)，從中藥復雜體系中成功篩選出多種α-葡萄糖苷酶抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑，并考察了中藥提取物與生物大分子DNA、人血清白蛋白的相互作用。Zhou等[21]利用離心超濾質(zhì)譜技術(shù)成功地從刺五加葉中鑒定出7種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物質(zhì)，包括4種黃酮類化合物、3種酚酸類化合物。然后，利用體外酶活性測定方法進一步比較了刺五加葉提取物中各相關(guān)化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明，黃酮醇類糖苷與α-葡萄糖苷酶的作用強度與糖配基的類型有關(guān)；咖啡?？鼘幩犷惢衔锏摩?葡萄糖苷酶抑制活性不僅與咖啡?；臄?shù)目有關(guān)，而且與咖啡?；涂鼘幩峄鶊F連接的位點有關(guān)。Liu等[22]運用超濾篩選結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-DAD-ESI-MSn)和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)技術(shù)成功地從丹參提取物中篩選出12種具有黃嘌呤氧化酶抑制作用的物質(zhì)，并運用Nikolic等[19]評價COX-2抑制劑抑制能力的計算公式，得到這12種配體的富集因子。研究結(jié)果表明，1,2-萘醌基團是抑制劑發(fā)揮抑制作用的重要結(jié)構(gòu)，脂環(huán)上的呋喃和羥基取代可以不同程度增強抑制劑的抑制能力，這一結(jié)果可為研發(fā)治療痛風的藥物提供借鑒。

超濾質(zhì)譜技術(shù)以快速、靈敏、高通量的特點被廣泛應(yīng)用于篩選中藥提取物中的活性成分。但是，目前超濾質(zhì)譜技術(shù)還存在一些不足，例如，化合物與目標靶蛋白的非特異性結(jié)合會導致假陽性結(jié)果，從而使篩選出的化合物表現(xiàn)出活性很弱或者完全沒有活性。為減少假陽性結(jié)果，在超濾篩選時可以引入變性酶作為對照組。Yang等[23]分別以活性酪氨酸酶和變性酪氨酸酶為靶標進行了2個平行實驗，采用UPLC-DAD-MSn技術(shù)對實驗組和對照組的濾液進行分析，從桑椹葉提取物中成功篩選鑒定出12種具有酪氨酸酶結(jié)合活性的物質(zhì)，再通過體外酶活性實驗進行驗證，最后發(fā)現(xiàn)了槲皮素D-吡喃葡萄糖苷和山奈酚D-吡喃葡萄糖苷2種新的酪氨酸酶抑制劑。

引入變性酶作為對照組雖然在一定程度上可以減少假陽性結(jié)果，但是，一些靶蛋白變性后溶解度會下降，影響篩選結(jié)果。為解決這一問題，Song等[24]引入了靶蛋白酶活性位點阻斷劑，從菊花中篩選并鑒定出4種黃嘌呤氧化酶抑制劑。非布索坦是黃嘌呤氧化酶的強效抑制劑，當其在復雜體系中與潛在的抑制酶共存時，能夠與潛在配體在黃嘌呤氧化酶活性位點上產(chǎn)生競爭性結(jié)合，從而間接減少化合物和靶分子的過度結(jié)合。利用這一特性，通過比較添加了競爭性配體(非布索坦)的實驗組和未添加非布索坦的對照組解離液的色譜圖，發(fā)現(xiàn)具有潛在抑制活性的物質(zhì)在實驗組的色譜圖中的峰高要明顯低于對照組，實驗過程示于圖2。此實驗結(jié)果表明，加入酶活性位點阻斷劑可以有效減少非特異結(jié)合引起的假陽性結(jié)果，從而提高親和超濾的準確性。在此基礎(chǔ)上，該課題組將親和超濾與分子芯片對接技術(shù)相結(jié)合，研究小分子與酶的相互作用，篩選潛在的天然酶抑制劑[25]。具體篩選過程為：首先，利用親和超濾質(zhì)譜技術(shù)從提取物中篩選出小分子活性物質(zhì)；其次，對篩選出的小分子活性物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)改造，得到一系列新的化合物；最后，利用分子芯片對接技術(shù)模擬結(jié)構(gòu)改造后的新化合物與靶分子之間的相互作用，預測它們的活性，并結(jié)合體外酶活性實驗進行驗證。該課題組將超濾與分子芯片對接技術(shù)應(yīng)用于篩選中藥復方制劑脈絡(luò)寧注射劑中的黃嘌呤氧化酶(XOD)抑制劑成分，成功篩選并鑒定出3種能夠與XOD特異性結(jié)合的活性成分。通過對篩選得到的3種成分進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到14種化合物，利用分子對接技術(shù)模擬了此14種化合物與XOD的結(jié)合情況，通過預測這些物質(zhì)的活性并結(jié)合體外酶活性實驗，最終發(fā)現(xiàn)3,4-二咖啡?？鼘幩峒柞ズ?,5-二咖啡?？鼘幩峒柞閄OD的強效抑制劑，且測得此二者的IC50值低于已上市的抗痛風藥別嘌呤醇。由此可見，利用超濾質(zhì)譜技術(shù)不僅可以從中藥提取物中直接篩選活性物質(zhì)，還可以結(jié)合計算機模擬技術(shù)對已鑒定的活性物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)改造形成組合化學庫，從而進行二次篩選，可為高活性中藥先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供信息和思路。

線粒體不僅是細胞內(nèi)能量合成的重要場所，還與氧自由基的產(chǎn)生、細胞死亡進程調(diào)控有關(guān)。早期研究表明[26]，帕金森病、阿爾茨海默氏癥、糖尿病、腫瘤等疾病和衰老均與線粒體功能異常有關(guān)，因此，以線粒體為藥理學靶點的藥物篩選意義重大。不同于常見的以單一靶蛋白為靶標從復雜基質(zhì)中篩選活性物質(zhì)，Yang等[27]通過離心超濾與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了以線粒體為靶向的生物活性篩選平臺，并使用陽性對照組對該方法的適用性進行評價，優(yōu)化了靶細胞器、樣品濃度和孵育時間，成功地檢測到19種生物活性化合物，并通過體外藥理學實驗證實其中9種物質(zhì)能夠與靶線粒體活性位點結(jié)合。楊興鑫等[28]應(yīng)用基于線粒體的離心超濾-液相色譜-質(zhì)譜法，從中藥葛根和川芎中篩選得到了23種可與線粒體結(jié)合的活性化合物，并鑒定了其中17種化合物。在此基礎(chǔ)上，采用體外藥理學實驗證實了7種化合物具有調(diào)節(jié)線粒體功能的作用。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，洋川芎內(nèi)A和3’-羥基葛根素可抑制HepG2細胞增殖，提高缺氧/復氧所致?lián)p傷的心肌細胞存活率。該研究結(jié)果可為深入闡釋中藥治療線粒體相關(guān)疾病的機理及開發(fā)線粒體靶向新藥提供重要的科學依據(jù)。

圖2 加入非布索坦阻斷劑的親和超濾篩選示意圖[24]Fig.2 General workflow for AUF-MS screening method combined with febuxostat[24]

有研究者將親和超濾和代謝組學技術(shù)相結(jié)合進行了藥物機制研究。Fu等[29]應(yīng)用基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學分析技術(shù)從甘草粗提物中發(fā)現(xiàn)了30種和22種分別能與埃博拉病毒核蛋白和馬爾堡病毒核蛋白結(jié)合的配體，經(jīng)混合物單體分離、單體活性測定法結(jié)合生物化學分析方法，最終確定18-β甘草次酸和甘草查兒酮A能夠顯著降低病毒核蛋白的熱穩(wěn)定性并誘導形成核蛋白寡聚體，且應(yīng)用生化實驗證實18-β甘草次酸能有效阻止病毒RNA片段與埃博拉病毒核蛋白的結(jié)合。該研究結(jié)果揭示了中藥甘草在抗病毒方面的作用機制，為抗病毒藥物的開發(fā)提供了借鑒，并且為中藥甘草相關(guān)的復方研究提供了實驗數(shù)據(jù)。

近年來，親和超濾質(zhì)譜與細胞和生化實驗相結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于中藥提取物活性物質(zhì)篩選研究中。近6年來，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥有效成分篩選中的研究實例列于表1。

表1 親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用[9,17]Table 1 Application of AUF-MS to target-oriented drug discovery in screening active components of TCMs[9,17]

續(xù)表1

3 結(jié)論與展望

中藥發(fā)揮藥理作用具有多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點。因此，如何快速、一體化地實現(xiàn)中藥多種活性成分篩選及鑒定是艱巨卻意義重大的工作?；诎袠?，以生物活性為導向的親和超濾質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，提高了從復雜中藥成分體系中識別目標成分的特異性和靈敏性，且能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，已被研究者廣泛應(yīng)用到特定靶標的活性物質(zhì)篩選中。在未來的研究中，可考慮以超濾技術(shù)為核心，設(shè)計在線超濾池，通過將多個超濾池并聯(lián)后與液相色譜串聯(lián)，進一步實現(xiàn)樣品的高通量超濾篩選。這樣，超濾技術(shù)不但可用于研究1種藥物與單一作用靶點或多個靶點的相互作用，還可研究多種藥物與單一作用靶點或多個靶點的相互作用，符合中藥治療疾病的整體作用理論。此外，超濾技術(shù)也可用于研究中藥小分子作用機制。隨著超濾膜分離和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)將在中藥活性成分研究，特別是高通量篩選方面發(fā)揮更大的作用。