馮穎 譚暢 蘇佳怡

摘要：對(duì)經(jīng)樹(shù)脂純化后的紫薯游離酚和結(jié)合酚提取物分別進(jìn)行體外清除DPPH自由基及α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)。結(jié)果表明：紫薯游離酚和結(jié)合酚提取物清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.014 mg/mL和2.020 mg/mL，α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分別為0.160 mg/mL和0.980 mg/mL，說(shuō)明紫薯多酚提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力；經(jīng)體外模擬胃消化1 h、腸消化2 h后，游離酚和結(jié)合酚含量均下降，且前者下降幅度大于后者。

關(guān)鍵詞：紫薯；游離酚；結(jié)合酚；DPPH自由基；α-葡萄糖苷酶；體外模擬胃腸消化

中圖分類號(hào)：TS215 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2018）04-0048-04

多酚是一類含有多個(gè)羥基的酚類植物成分的總稱，主要包括花色苷、原花色素、黃酮醇類等。多酚在植物體內(nèi)以游離酚和結(jié)合酚兩種形式存在，前者為游離型，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較多；后者則是與細(xì)胞壁中多糖、蛋白質(zhì)等結(jié)合，以結(jié)合型存在，以往在研究中往往被忽略，近些年才逐漸得到關(guān)注。大量科學(xué)研究表明，植物多酚具有多種生物活性和生理功能，如清除自由基、抗癌、抗輻射、降血脂、提高機(jī)體免疫力等。多酚類化合物在人體中發(fā)揮其作用前，首先要經(jīng)過(guò)人體胃腸道的消化，所以多酚類化合物的消化穩(wěn)定性成為當(dāng)前食品和功能性食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。例如：Marchese等人研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胃和十二指腸模擬消化后，綠茶飲料中的單寧類化合物均大幅度降低，且經(jīng)過(guò)胃腸道消化后其抑菌活性消失；Corrê等人研究表明，胃腸道消化過(guò)程會(huì)大大降低葡萄皮提取物中多酚類化合物的種類和含量，并降低其抗氧化和抑菌活性。紫薯為旋花科番薯屬植物，其中富含膳食纖維、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還富含花色苷、綠原酸、類黃酮等多酚類物質(zhì)。目前的研究主要集中在紫薯花色苷方面，而對(duì)紫薯多酚研究較少，特別是結(jié)合酚方面研究缺乏。本課題對(duì)紫薯游離酚與結(jié)合酚的自由基清除活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，以期為將紫薯多酚應(yīng)用于抗氧化和降低餐后血糖方面提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用甘薯：品種為“遼薯20”，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

DPPH：TCI公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），α-葡萄糖苷酶：美國(guó)Sigma公司；大孔樹(shù)脂HPD-100：滄州寶恩化工有限公司；無(wú)水乙醇、福林酚試劑、氫氧化鈉、碳酸鈉：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

新陽(yáng)LG0.2型真空冷凍干燥機(jī)：新陽(yáng)速動(dòng)設(shè)備制造有限公司；電子天平：上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9070A型恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；CR21G型冷凍離心機(jī)：日立有限公司；pH計(jì)：上海榮漢自動(dòng)化儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HL-2型數(shù)顯恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取物的制備 1） 游離酚與結(jié)合酚的提取。取50 g紫薯凍干粉，以料液比 1∶10的比例加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇水溶液，于50 ℃水浴中放置2 h提取游離酚，10 000 r/min離心20 min，離心后收集上清液，保留濾渣；按上述步驟重復(fù)提取2次，至游離酚提取完全，合并上清液即為游離酚粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇后備用。將充分提取游離酚后的濾渣真空干燥至質(zhì)量恒定，取干燥甘薯渣，以料液比1∶10加入2 mol/L的NaOH溶液，于室溫下用磁力攪拌器水解5 h以釋放結(jié)合酚，水解結(jié)束后以10 000 r/min離心20 min，棄去濾渣，收集上清液即為結(jié)合酚粗提液。2） 游離酚的純化。用AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行紫薯游離酚純化（Φ1.5 cm×40.0 cm）。上樣液濃度為1.00 mg/mL，上樣液pH值為3.0，上樣體積為5.4 BV，解吸液為pH值7.0、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液（用量6.8 BV），收集解吸液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到紫薯游離酚提取物。3） 結(jié)合酚的純化。用HPD-100大孔樹(shù)脂進(jìn)行紫薯結(jié)合酚純化（Φ1.5 cm×40.0 cm）。上樣液濃度為0.25 mg/mL，上樣液pH值為3.0，上樣體積為3.6 BV，解吸液為pH值5.0、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液（用量6.8 BV），收集解吸液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到紫薯結(jié)合酚提取物。

1.3.2 紫薯多酚對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定 在具塞試管中分別加入以50%乙醇溶解的不同濃度的游離酚和結(jié)合酚提取物2.0 mL，再加入1.0×10-4 mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液2.0 mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，在525 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)sample，同時(shí)用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，按照下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

自由基清除率=×100%

式中：Ablank為將DPPH溶液換成無(wú)水乙醇后測(cè)定的吸光度值；Acontrol為將待測(cè)溶液換成體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液后測(cè)定的吸光度值。

1.3.3 紫薯多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 分別將以50%乙醇溶解的不同濃度的游離酚和結(jié)合酚提取物0.1 mL與0.1 mol/L的pH值6.8的磷酸緩沖液0.4 mL混合，加入0.1 mL以pH值6.8的磷酸緩沖液配制的濃度為0.005 g/mL的α-葡萄糖苷酶液，于37 ℃水浴中保溫10 min，再加入0.4 mL濃度為5 mmol/L的PNPG溶液（以pH值6.8的磷酸緩沖液配制），繼續(xù)水浴30 min，用2.0 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，取此反應(yīng)液0.5 mL，再加入蒸餾水稀釋至5.0 mL，在400 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)sample，同時(shí)用阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，按照下列公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

α-葡萄糖苷酶抑制活性=×100%

式中：Ablank為將酶液換為0.1 mL磷酸緩沖液后測(cè)定的吸光度值；Acontrol為將待測(cè)液換為0.1 mL 50%乙醇水溶液后測(cè)定的吸光度值。

1.3.4 體外模擬胃腸消化過(guò)程中紫薯多酚穩(wěn)定性的測(cè)定 1） 樣液配制。以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇分別溶解游離酚和結(jié)合酚提取物并定容，配制濃度為12 mg/mL的游離酚提取物待測(cè)液和100 mg/mL的結(jié)合酚提取物待測(cè)液。2） 模擬胃腸消化。取兩支比色管，分別加入4.0 mL生理鹽水和4.0 mL胃液，混勻，以0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)整pH值至2.0～2.5，于37 ℃下100

r/min搖床振蕩1 h，其中一支以生理鹽水定容至10.0 mL進(jìn)行測(cè)定，另一支以1.0 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，再加入1.8 mL腸液，于37 ℃下100 r/min搖床振蕩2 h，以生理鹽水定容至20.0 mL進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)測(cè)定模擬胃液和腸液消化前后紫薯多酚類物質(zhì)含量的變化，研究各種游離酚和結(jié)合酚提取物中各酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.3.5 多酚含量的測(cè)定 1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取沒(méi)食子酸0.1 g，用蒸餾水配制成1mg/mL的溶液，分別吸取該溶液0，0.3，0.5，1.0，1.2，1.5 mL于10.0 mL刻度試管中，用蒸餾水定容搖勻。然后從各濃度溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL刻度試管中，分別用蒸餾水定容到5.0 mL，再加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入0.5 mol/L碳酸鈉溶液1.0 mL，搖勻后放置1 h，于725 nm下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次。2） 樣品測(cè)定。取樣液0.5 mL，參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中多酚類化合物的含量。

1.3.6 黃酮含量的測(cè)定 1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇配制成0.25 mg/mL的溶液，分別吸取該溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，

4.0 mL于10.0 mL刻度試管中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容，再?gòu)母魅芤褐形?.5 mL加入到10.0 mL刻度試管中，加體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇至5.0 mL，加0.3 mL 5%的NaNO2，混勻后避光靜置6 min，加0.3 mL 10%的Al（NO3）3，混勻后避光靜置6 min，最后加入4.0 mL 4%的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容至10.0 mL，混勻，避光反應(yīng)15 min，于510 nm下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次。2） 樣品測(cè)定。取樣液0.5 mL，參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中黃酮類化合物的含量。

1.3.7 酚酸含量的測(cè)定 1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用無(wú)水乙醇配制成0.25 mg/mL的溶液，分別吸取該溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于10.0 mL刻度試管中，用無(wú)水乙醇定容。然后從各溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL容量瓶中，加5.0 mL無(wú)水乙醇，再分別加入2.0 mL 0.3%的十二烷基硫酸鈉、1.0 mL 1%的三氯化鐵、1.0 mL 1%的鐵氰化鉀，用0.1 mol/L的鹽酸定容至10.0 mL，放置于避光處反應(yīng)20 min，于740 nm下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次。2） 樣品測(cè)定。取樣液0.5 mL，參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其酚酸類化合物含量。

1.3.8 花色苷含量的測(cè)定 將樣品分別用pH值1.0的0.025 mol/L的氯化鉀和pH值4.5的0.4 mol/L的乙酸鈉稀釋，放置15 min后分別于530 mm和700 nm處測(cè)定吸光度，以樣品用蒸餾水稀釋后在530 nm和700 nm處的吸光度作為空白，平行測(cè)定3次。按照下列公式計(jì)算總吸光度和花色苷濃度：

總吸光度OD=（OD530 nm-OD700 nm）pH 1.0-（OD530 nm-

OD700 nm）pH 4.5

花色苷濃度（以矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)，mg/mL）=

式中：OD為總吸光度；MW為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；l為比色杯的寬度，1 cm；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

不同物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率如圖1所示。

由圖1可以看出：紫薯游離酚與結(jié)合酚提取物均具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，且隨著濃度增大，其對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸提高。其中，游離酚提取物濃度在0.010～0.040 mg/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度增大迅速提高；當(dāng)濃度達(dá)到0.040 mg/mL以后，其對(duì)DPPH自由基清除率提高幅度不明顯。利用SPSS軟件計(jì)算得到游離酚清除DPPH的IC50為0.014 mg/mL，當(dāng)濃度達(dá)到0.045 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到90.39%±0.22%。與紫薯游離酚相比，紫薯結(jié)合酚對(duì)DPPH自由基的清除率較低，其IC50為2.020

mg/mL，當(dāng)結(jié)合酚濃度達(dá)到5.000 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到85.16%±0.29%。

2.2 紫薯多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

不同物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率如圖2所示。

由圖2可以看出：隨著紫薯游離酚與結(jié)合酚提取物濃度增加，它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均增強(qiáng)。其中，紫薯游離酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性更強(qiáng)，利用SPSS軟件計(jì)算得出游離酚抑制酶活性的IC50為0.160 mg/mL；紫薯結(jié)合酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性雖低于紫薯游離酚，但與對(duì)照品阿卡波糖相近，說(shuō)明其對(duì)酶的抑制活性也較好，利用SPSS軟件計(jì)算得出其IC50為0.980 mg/mL。

2.3 紫薯多酚體外模擬胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性

2.3.1 紫薯游離酚穩(wěn)定性 紫薯游離酚在體外模擬胃腸消化過(guò)程中的含量變化情況見(jiàn)表1。

由表1可知：在胃中胃酸和消化酶的作用下，總酚、黃酮、花色苷、酚酸的含量均呈下降趨勢(shì)，分別下降了78.03%，85.25%，42.65%，85.35%；在腸消化酶的作用下，總酚、黃酮、花色苷的含量繼續(xù)下降，分別下降了6.40%，13.04%，74.39%，而酚酸含量則有一定程度的上升，可能是其他酚類物質(zhì)在腸道內(nèi)分解成酚酸所致。比較各多酚類物質(zhì)在胃和腸中的含量下降幅度可知，胃內(nèi)消化對(duì)紫薯游離酚中總酚、黃酮和酚酸的降解大于腸內(nèi)消化，但花色苷在腸中降解程度大于胃中。

2.3.2 紫薯結(jié)合酚穩(wěn)定性 紫薯結(jié)合酚在體外模擬胃腸消化過(guò)程中的含量變化情況見(jiàn)表2。

由表2可知：在胃中胃酸和消化酶的作用下，總酚、黃酮、花色苷、酚酸的含量均呈下降趨勢(shì)，分別下降了33.85%，45.24%，89.29%，15.00%，其中以花色苷含量下降幅度最大；經(jīng)腸消化2 h后，總酚含量繼續(xù)下降，而黃酮、花色苷、酚酸特別是花色苷的含量呈一定程度的上升，說(shuō)明腸液的消化促進(jìn)了它們從與其他物質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)下進(jìn)一步釋放出來(lái)。

3 結(jié)論

1） 經(jīng)樹(shù)脂純化后的紫薯游離酚和結(jié)合酚提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.014 mg/mL和2.020 mg/mL，游離酚的活性強(qiáng)于結(jié)合酚，當(dāng)游離酚提取濃度達(dá)到0.040 mg/mL時(shí)，其清除DPPH自由基的活性接近相同濃度的抗壞血酸（對(duì)照）。

2） 紫薯游離酚與結(jié)合酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分別為0.160 mg/mL和0.980 mg/mL，紫薯游離酚提取物活性要優(yōu)于阿卡波糖（對(duì)照），而結(jié)合酚提取物活性則與阿卡波糖相近。

3） 體外模擬胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，紫薯游離酚類物質(zhì)在胃中消化過(guò)程中含量下降幅度較大，而腸液對(duì)其含量下降影響較?。慌c游離酚相比，紫薯結(jié)合酚類物質(zhì)（花色苷除外）含量在胃中下降幅度較小，而在腸消化過(guò)程中還會(huì)呈一定程度的上升趨勢(shì)。

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