張嚴(yán)焱，徐召霞，陳 渝，李珊珊，石麗君

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運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈LTCC和BKCa通道功能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

張嚴(yán)焱，徐召霞，陳 渝，李珊珊，石麗君

北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生理教研室, 北京 100084

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)改善自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌L型電壓門控鈣通道（voltage-gated L-type Ca2+channel，LTCC）和大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large-conductance Ca2+-activated K+channel，BKCa）功能的表觀遺傳機(jī)制。方法：12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rat，SHR）及正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto，WKY），隨機(jī)分為正常血壓安靜組（WKY-SED）、正常血壓運(yùn)動(dòng)組（WKY-EX）、高血壓安靜組（SHR-SED）和高血壓運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX），運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。12周后，取腸系膜動(dòng)脈，分別采用膜片鉗，鈣成像、免疫蛋白印跡、qPCR、亞硫酸氫鹽測序技術(shù)觀察血管平滑肌LTCC、BKCa通道全細(xì)胞電流，BKCa單通道門控特性，鈣火花，LTCC α1c、BKCaα和β1亞基mRNA、蛋白表達(dá)，α1c、β1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，miR-328表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行血管平滑肌原代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-328 mimic和miR-328 inhibitor使之過表達(dá)或沉默，干擾48 h后檢測α1c亞基mRNA、蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：1）有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY和SHR運(yùn)動(dòng)組收縮壓均分別顯著低于各自安靜對照組；2）運(yùn)動(dòng)顯著減弱SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌LTCC和BKCa全細(xì)胞電流密度的上調(diào)；3）運(yùn)動(dòng)降低高血壓BKCa通道開放概率（P）及鈣火花幅值的升高；4）運(yùn)動(dòng)顯著抑制了SHR腸系膜動(dòng)脈BKCaβ1亞基mRNA、蛋白表達(dá)上調(diào)；高血壓時(shí)β1基因啟動(dòng)子區(qū)呈去甲基化，經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后甲基化水平升高；5）LTCC α1c蛋白表達(dá)在SHR-SED組顯著上調(diào)，SHR-EX組α1c表達(dá)下調(diào)；腸系膜動(dòng)脈miR-328表達(dá)與α1c亞基蛋白表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)；6）轉(zhuǎn)染miR-328 mimic 48 h后，α1c亞基蛋白表達(dá)顯著下降；miR-328 inhibitor組，α1c亞基表達(dá)稍上調(diào)無顯著差異。結(jié)論：規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低SHR血壓，引起β1亞基啟動(dòng)子區(qū)甲基化，調(diào)控miR-328在轉(zhuǎn)錄后靶向抑制α1c亞基表達(dá)，是運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa和LTCC通道功能重構(gòu)的表觀遺傳機(jī)制之一。

運(yùn)動(dòng)；離子通道；DNA甲基化；微小RNA

高血壓是重要的全球性公共衛(wèi)生問題，困擾著全世界約1/4的人口；同時(shí)也是中風(fēng)，冠狀動(dòng)脈疾病，心衰等心血管疾病和腎臟病變的主要危險(xiǎn)因素[22]。在高血壓的病理過程中始終伴隨著外周阻力動(dòng)脈的血管張力的增加以及血管舒張能力的下降[10]。小動(dòng)脈和微動(dòng)脈是外周阻力形成的主要部位，除了神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)之外，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC）能直接調(diào)控血管收縮，其膜上離子通道的正常活動(dòng)是血管平滑肌興奮收縮過程的關(guān)鍵。有研究表明，高血壓下觀察到的血管張力增加與VSMC膜上的“離子通道重構(gòu)”有關(guān)[20]，其中，Ca2+和K+通道在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平、控制靜息膜電位和細(xì)胞收縮中扮演著重要的角色[12,20,30,33]。

VSMC膜上表達(dá)多種K+和Ca2+通道。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated K+channel，BKCa）是最為重要的K+通道家族成員之一，其廣泛分布于VSMC上，在膜去極化和局部[Ca2+]i升高條件下激活；參與調(diào)節(jié)靜息膜電位(Em），同時(shí)，BKCa通道的開放是血管平滑肌舒張的重要機(jī)制[5,6,28,30]。L型電壓門控鈣通道(voltage-gated L-type Ca2+channel，LTCC）也在膜去極化條件下激活，VSMC興奮，膜去極化，導(dǎo)致LTCC通道電壓依賴的開放，Ca2+內(nèi)流，全胞鈣升高，誘發(fā)VSMC收縮機(jī)制[15,29,37]。因此，LTCC和BKCa通道之間的平衡在調(diào)控膜去極化-超級化，VSMC收縮-舒張以及血管張力中起重要作用。

規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)是有效預(yù)防和控制高血壓的非藥物治療方法，諸多研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)與VSMC離子通道功能改善存在密切關(guān)系[1,2,31,32]，但目前運(yùn)動(dòng)調(diào)控血管平滑肌離子通道功能的潛在機(jī)制仍不清楚。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)迅速發(fā)展，表觀遺傳（epigenetic）修飾搭建起了環(huán)境-基因之間的橋梁或中介，而高血壓的發(fā)生正是由多種遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的[22]；同時(shí)，與基因突變所不同的是，表觀遺傳改變具有可逆性，可作為高血壓治療的有效新藥物靶點(diǎn)。規(guī)律運(yùn)動(dòng)作為環(huán)境表觀遺傳調(diào)制器，可在不影響DNA編碼的前提下，通過誘導(dǎo)表觀遺傳修飾調(diào)控高血壓相關(guān)基因的表達(dá)水平，改善心血管功能[25,36]。

表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化，組蛋白質(zhì)修飾和非編碼microRNA。DNA甲基化是指基因組DNA在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶，被選擇性地添加甲基，轉(zhuǎn)變?yōu)?’甲基胞嘧啶[21]。DNA甲基化可從轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控下游功能蛋白，關(guān)閉某些基因的活性[21]。近期研究表明，啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平能夠調(diào)控VSMC離子通道表達(dá)和功能[11,18,23]。microRNA（miRNA，miR）是一類高度保守內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它能與靶基因mRNA分子特異性結(jié)合，直接降解靶mRNA或負(fù)向調(diào)控mRNA的翻譯，是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[9]。miRNA作為表觀調(diào)控的重要組成部分在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，參與調(diào)節(jié)VSMC離子通道功能[16,19]。在肺動(dòng)脈和心肌細(xì)胞中，miR-328均被證實(shí)能夠靶向作用于LTCCα1c亞基[16]。那么，規(guī)律運(yùn)動(dòng)作為一種良性刺激，是否能夠使得DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，或引起miRNA改變，進(jìn)而影響LTCC和BKCa通道的表達(dá)和功能變化，改善血管舒縮功能，目前尚不清楚。

因此，本研究旨在觀察原發(fā)性高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈LTCC和BKCa通道功能變化，并從表觀遺傳角度，探討啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化以及miR-328在運(yùn)動(dòng)干預(yù)高血壓腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌LTCC和BKCa通道功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

1.2 電生理記錄

1.2.1 腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞急性分離

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg），麻醉后，取腸系膜動(dòng)脈，剝離干凈后置于無鈣分離液中；將腸系膜動(dòng)脈2~3級剪成1 mm的小段，室溫平衡5 min后，置于酶消化液中，37℃恒溫水浴箱中消化27~30 min。待消化完全后，置于室溫下分離液漂洗3次終止消化，每次5 min。然后用拋光后的玻璃吸管輕輕吹打，吸取細(xì)胞懸液經(jīng)濾網(wǎng)過濾至細(xì)胞浴槽內(nèi)，4℃貼壁待用。

酶消化液組成成分：2 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）、 4 mg/ml木瓜蛋白酶（Papain）、1 mg/ml二硫蘇糖醇（DDT）、0.6 mg/ml F型膠原酶溶于分離液中。分離液組成成分（mmol/L）：137 NaCl、5.6 KCl、1 MgCl2、 10 HEPES、10 Glucose、0.42 Na2HPO4，0.44 NaH2PO4， 4.2 NaHCO3，NaOH調(diào)pH至7.3。

1.2.2 全細(xì)胞電流記錄

LTCC電流測定采用膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗記錄模式；細(xì)胞在-80 mV鉗制電壓，檢測電壓為-70~+70 mV，階躍10 mV，持續(xù)200 ms。所測電流信號(hào)經(jīng)Axon 700B amplifier放大，低通濾波2 kHz，采樣頻率10 kHz。在Clampfit 10.2軟件控制下，進(jìn)行A/D、D/A轉(zhuǎn)換，采用pCLAMP 10.2軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并分析。為了增大單位電流，用Ba2+替代Ca2+作為電荷載體，以限制電流衰減。電極內(nèi)液成分（mmol/L）：130 CsCl、10 HEPES、3 Na2ATP、0.1 Na2GTP、1.5 MgCl2、10 Glucose、10 EGTA、0.5 MgATP，CsOH調(diào)pH至7.3。細(xì)胞外液成分（mmol/L）：20 BaCl2、10 HEPES、5 Glucouse、1 MgCl2、124 choline chloride，CsOH調(diào)pH至7.4。

全細(xì)胞K+電流（IK）采用傳統(tǒng)電壓鉗記錄模式。細(xì)胞外液成分（mmol/L）：134 NaCl、6 KCl、1 MgCl2、1.8 CaCl2、10 Glucose、10 HEPES（pH 7.4）。電極內(nèi)液成分（mmol/L）：110 K-Asp、30 KCl、1 EGTA、3 Na2ATP、0.85 CaCl2、10 Glucouse、10 HEPES（pH 7.2）。電流-電壓（I-V）曲線獲得條件：細(xì)胞鉗制電壓在-80 mV，逐步去極至+70 mV，階躍+10 mV，脈沖時(shí)程為350 ms。細(xì)胞外液孵育BKCa通道特異性阻斷劑IbTX（100 nmol/L），IbTX敏感電流即為BKCa通道電流。

1.2.3 單通道紀(jì)錄

BKCa單通道電流采用膜片鉗內(nèi)面向外記錄模式。細(xì)胞內(nèi)外液采用對稱性高K+（145 mmol/L）方式，電極電阻10~15 MΩ，電極內(nèi)液成分（mmol/L）：100 KCl、45 K-aspartate、1 EGTA、10 Hepes、5 Glucose（pH 7.4）。浴液中的游離Ca2+濃度（[Ca2+]free）通過加入適量CaCl2和EGTA控制，所用CaCl2和EGTA的量利用WinMax C軟件（http://maxchelator.stanford.edu/webmaxc/webmaxcS.htm）計(jì)算得到。單通道電流信號(hào)經(jīng)Axon 700B amplifier放大，在Clampfit 10.2軟件控制下，進(jìn)行A/D，D/A轉(zhuǎn)換，采樣頻率10 kHz，8極Bessel低通濾波2 kHz。每個(gè)電壓下持續(xù)穩(wěn)定記錄至少2 min用于通道開放概率（）分析，采用pCLAMP 10.2軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 鈣成像

急性分離的腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞種于玻底培養(yǎng)皿，貼壁30 min后，室溫負(fù)載鈣離子染料Fluo-4 AM（5 μmol/L）約25~30 min后，用含1.5 mmol/L CaCl2的分離液清洗3遍，每次10 min；分離液成分（mmol/L）： 137 NaCl、5.6 KCl、1 MgCl2、10 HEPES、10 Glucose、0.03硝普鈉（pH 7.4）。負(fù)載上Fluo-4 AM的平滑肌細(xì)胞將基于Leica DMi8全內(nèi)反射熒光（total internal reflection fluorescence，TIRF）系統(tǒng)捕捉鈣火花（Ca2+spark）信號(hào)，激發(fā)光488 nm，采樣頻率30~90 Hz，采樣參數(shù)28 ms/page。

鈣火花數(shù)據(jù)采用Image J圖像處理軟件（NIH，USA）和Matlab數(shù)學(xué)軟件（MathWorks，USA）自編程序進(jìn)行分析。采集圖片導(dǎo)入Image J后，沿鈣火花邊緣圈出所需ROI（region of interest），得到ROI的平均灰度值（mean intensity），之后導(dǎo)入Matlab，經(jīng)自編程序運(yùn)行，得到每個(gè)ROI對應(yīng)的鈣離子熒光強(qiáng)度的變化曲線。鈣火花分析為F/F=F-F/F-F，其中，為ROI的平均熒光強(qiáng)度，F為開始采集信號(hào)但無鈣火花發(fā)生時(shí)所選細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值，F為圖片背景熒光強(qiáng)度。本研究中鈣火花的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)是F/F＞1.2。

1.4 免疫蛋白印跡

腸系膜動(dòng)脈平滑肌提取總蛋白，制備SDS-PAGE電泳樣品，上樣量為20 μg。電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA封閉后，4°C過夜孵育一抗Rabbit polyclonal anti-α1c（1:200），Rabbit polyclonal anti-KCa1.1（1:300），Rabbit polyclonalanti-sloβ1（1:300），一抗均購于Alomone Laboratories。次日二抗anti-rabbit IgG-HRP（1:10 000，Proteintech Group）室溫孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光，置于Bio-Rad Chemi DOC XRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，USA）獲取特異性免疫反應(yīng)發(fā)光條帶。β-actin或GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.5 RT-PCR

腸系膜動(dòng)脈平滑肌提取mRNA，采用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit（ThermoFisher）反轉(zhuǎn)成cDNA；Taqman Fast Advanced Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為50℃ 2 min，95℃ 2 min，之后擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)（95℃ 3s、60℃ 30 s）。LTCC α1c亞基（）、BKCaα亞基（）、BKCaβ1亞基（）、內(nèi)參基因β-actin的Taqman探針購于ThermoFisher。腸系膜動(dòng)脈miRNA提取采用miRcute miRNA提取試劑盒（Tiangen，Beijing）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)時(shí)miR-328及其對應(yīng)內(nèi)參U6應(yīng)用特異性莖環(huán)引物（miR-328：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGAACGGAAGG-3’；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCA CATATACT-3’）；之后Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增引物miR-328：5’-ATTATATCTGGCCC TCTCTGC-3’，5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3’；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，5’-ACGCTTCACG AATTTGCGTGTC-3’。目的基因表達(dá)以比較Ct法進(jìn)行相對定量。

1.6 亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

提取腸系膜動(dòng)脈基因組DNA，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit （ZYMO Research，Orange）對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。隨后在和基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島外圍（不含CpG位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物2%瓊脂糖檢測，切膠，使用TIANgel Midi Purification Kit （Tiangen，Beijing）對DNA回收純化；之后將PCR產(chǎn)物克隆至載體后，挑取10個(gè)克隆進(jìn)行測序?；蛞铮?’-GAATTTATTATGTTTTTTGGAGGTGA-3’，5’-ATCTCAACTCACTTAACTTTTACTCTACC-3’；基因引物：5’-AGAGAAAATAGAGGTTTAGAGAGGTGT-3’，5’-ATCAAATCTAAACACACAACTTACTCC-3’。甲基化結(jié)果以甲基化百分比表示：甲基化CpG/（甲基化CpG+未甲基化CpG）×100%。

1.7 VSMC原代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取健康雄性、12周齡Wistar大鼠，乙醚麻醉，滅菌后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)。迅速取出腸系膜動(dòng)脈0級，置于HBSS中，剝離外周脂肪組織，將動(dòng)脈剪成7~9 mm長度；膠原酶37℃消化45 min后，剝離血管外膜和內(nèi)皮；將剩余血管剪成1×1 mm碎片，置于彈性蛋白酶中37℃消化30~35 min后，巴氏吸管吹打直至組織碎片消失；離心后棄上清，加入含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基重懸后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，48 h后換液。VSMC傳至5~7代后進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用Lipofectamine RNAiMAX試劑將各miR-328干擾序列轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，miR-328 mimic （5’-CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3’，5’-GGAAGGGCAGAGAGGGCCAGUU-3’）；miR-328 inhibitor （5’-ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3’）；NC （5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）。在轉(zhuǎn)染后 6 h，轉(zhuǎn)染效率高低在熒光顯微鏡下通過熒光標(biāo)記的siRNA （FAM-siRNA）實(shí)現(xiàn)；轉(zhuǎn)染效率到75%以上即轉(zhuǎn)染效果理想，可用于后續(xù)檢測。48 h，提取mRNA和蛋白進(jìn)行檢測。

1.8 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，正態(tài)分布檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，在滿足方差齊性檢驗(yàn)下，在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA，高血壓×運(yùn)動(dòng)）；離體實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對高血壓大鼠動(dòng)脈血壓的影響

12周齡SHR與WKY在體重上無顯著差異；經(jīng)12周有氧運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組體重（WKY-EX組：330.0±9.1 g；SHR-EX組：309.2±12.4 g）顯著低于各自安靜對照組（WKY-SED組：346.6±12.3 g；SHR-SED組：323.8±14.0 g；＜0.05）。

采用尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)對WKY和SHR實(shí)驗(yàn)前后的HR、SBP、DBP、MAP進(jìn)行測量。12周齡SHR組的收縮壓為191.6±13.2 mmHg，顯著高于WKY組（134.9± 6.4 mmHg，＜0.05）。經(jīng)12周有氧運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組的收縮壓，無論是WKY-EX組（131.2±9.2 mmHg），還是SHR-EX組（182.9±8.4 mmHg）都分別顯著低于WKY-SED（137.6±7.2 mmHg，＜0.05）和SHR-SED組（197.8±18.0 mmHg，＜0.05，表1）。

表1 有氧運(yùn)動(dòng)對WKY和SHR心率及血壓的影響

Table 1 Effects of Exercise Training on HR and BP of WKY and SHR

注：*表示與WKY-SED組相比＜0.05有顯著性差異，#表示與SHR-SED組相比＜0.05有顯著性差異，下同。

2.2 運(yùn)動(dòng)減弱SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌LTCC和BKCa電流

采用全細(xì)胞電壓鉗記錄模式對各組腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞LTCC和BKCa通道的電生理特性進(jìn)行鑒定。

如圖1-A，為記錄到的各組全細(xì)胞Ca2+電流示意圖，LTCC通道特異性阻斷劑Nifedipine（100 nmol/L）能夠抑制幾乎所有的內(nèi)向電流，提示，用Ba2+作為電流載體，記錄到的Ba2+電流即為LTCC通道開放產(chǎn)生。為消除細(xì)胞表面積不同對鈣電流大小產(chǎn)生的影響，所記錄到的全細(xì)胞LTCC通道電流均采用膜電容進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即電流密度（pA/pF）；得到圖1-B，電流-電壓（I-V）曲線圖，最大內(nèi)向電流峰值出現(xiàn)在+20 mV，各組腸系膜動(dòng)脈VSMC最大鈣電流密度分別為-10.5±1.1 pA/pF（WKY-SED組，n=14 cells），-12.6±1.0 pA/pF（WKY-EX組，n=16 cells），-17.1±2.2 pA/pF（SHR-SED組，n=20 cells），-12.4±2.4 pA/pF（SHR-EX組，n=18 cells）；電生理實(shí)驗(yàn)中n均代表細(xì)胞個(gè)數(shù)，來源于6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。可以看出，SHR-SED組最大鈣電流密度顯著高于WKY-SED組（＜0.05）；而運(yùn)動(dòng)顯著降低高血壓LTCC通道電流（＜0.05），但在正常血壓組，運(yùn)動(dòng)卻升高了WKY-EX組鈣電流密度（＜0.05）。

圖 1 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞LTCC通道電流

Figure 1. Whole-cell LTCC Currents Recorded in Mesenteric Artery Myocytes from Four Groups

注：A為各組全細(xì)胞Ca2+電流（黑色）及100 nmol/L Nifedipine（紅色）阻斷后Ca2+電流代表圖；B為各組腸系膜動(dòng)脈平滑肌LTCC通道電流-電壓（I-V）曲線圖。

在靜息膜電位方面，與WKY-SED組（-52.1±4.5 mV，n=30 cells）相比，SHR-SED組靜息Em去極化（-38.0±3.6 mV，n=31 cells）。12周運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組靜息膜電位為-44.3±2.7 mV（n=35 cells），顯著高于SHR-SED組；運(yùn)動(dòng)對WKY靜息Em無顯著影響（-50.3±4.2 mV，n= 35 cells）。BKCa通道特異性阻斷劑IbTX（100 nM）作用 10 min后，各組全細(xì)胞K+電流被顯著抑制，得到BKCa通道在全細(xì)胞IK電流中的貢獻(xiàn)。SHR-SED及WKY-EX組平滑肌細(xì)胞IbTX敏感電流，即BKCa電流均顯著高于WKY-SED組（＜0.05）（圖2-A）。當(dāng)鉗制電位是+70 mV時(shí)，WKY-SED、WKY-EX和SHR-SED組BKCa電流密度分別是14.7± 0.8 pA/pF（n=10 cells）、27.6±2.9 pA/pF（n=9 cells）、43.2±3.3 pA/pF（n=10 cells）（圖2-B）。在高血壓組，有氧運(yùn)動(dòng)顯著降低了SHR-EX組BKCa電流密度（25.4±2.7 pA/pF，n=12 cells，＜0.05）。

圖2 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌全細(xì)胞K+電流

Figure 2. Whole-cell K+Currents Recorded in Mesenteric Artery Myocytes from Four Groups

注：A為各組全細(xì)胞K+電流（黑色）及100 nmol/L IbTX（紅色）阻斷后K+電流代表圖。B為各組腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道電流-電壓（I-V）曲線圖。

以上結(jié)果提示，高血壓引起腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞LTCC和BKCa通道功能上調(diào)，而有氧運(yùn)動(dòng)可減弱高血壓引起的這些改變。值得注意的是，在正常血壓組，有氧運(yùn)動(dòng)沒有降低反而增大了VSMC全細(xì)胞LTCC和BKCa通道電流。

2.3 運(yùn)動(dòng)抑制SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道門控特性及鈣火花功能改變

為檢測BKCa通道全細(xì)胞電流變化是否與其單通道特性改變有關(guān)，本研究采用單通道內(nèi)面向外記錄模式對各組腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道功能及門控特性進(jìn)行鑒定。在[Ca2+]free=1 μmol/L，鉗制電壓在+40 mV，與WKY-SED組相比，高血壓BKCa通道開放概率（P）顯著增大（＜0.05）；12周有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組P顯著低于SHR-SED組（＜0.05），然而運(yùn)動(dòng)卻增強(qiáng)了正常血壓組BKCa通道活動(dòng)，WKY-EX組P明顯增加，顯著高于WKY-SED組（＜0.05）（圖3-A、圖3-B）。

局部[Ca2+]i升高，即VSMC胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上RyR開放產(chǎn)生的鈣火花（Ca2+spark）可激活附近的BKCa通道，因此，本研究采用鈣離子成像技術(shù)檢測了各組VSMC自發(fā)性鈣火花變化情況。如圖3-C所示，與WKY-SED組相比（1.21±0.06F/F，n=9 cells），WKY-EX組鈣火花幅值稍升高但無顯著差異（1.35±0.07F/F，n=12 cells，＞0.05）；SHR-SED組平滑肌細(xì)胞鈣火花幅值顯著增高（1.69±0.07F/F，n=14 cells，＜0.05）。運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組細(xì)胞鈣火花幅值為1.50±0.04F/F（n=10 cells），顯著低于SHR-SED組（＜0.05）。提示，鈣火花活動(dòng)改變可能是高血壓腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌BKCa通道功能上調(diào)，及運(yùn)動(dòng)后BKCa通道活動(dòng)改變的原因之一。

圖 3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa單通道電流及鈣火花特征

Figure 3. BKCaChannel Activity and Ca2+Spark Recorded in Mesenteric Artery Myocytes from Four Groups

注：A為HP=+40 mV，[Ca2+]free=1 μmol/L，各組腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道開放示意圖；B為BKCa通道開放概率（P）統(tǒng)計(jì)圖；C為各組平滑肌細(xì)胞鈣火花代表圖和鈣離子熒光強(qiáng)度變化曲線圖，圖中白色圓圈示意代表鈣火花區(qū)域。

2.4 各組腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌LTCC和BKCa通道蛋白及mRNA表達(dá)變化

免疫蛋白印跡及熒光定量PCR技術(shù)觀察各組大鼠腸系膜動(dòng)脈LTCC和BKCa通道亞基蛋白及mRNA表達(dá)改變。

如圖4-A、圖4-C所示，各組大鼠LTCC通道α1c亞基（240 KDa）蛋白表達(dá)，與WKY-SED組相比，SHR-SED組α1c亞基蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05），有氧運(yùn)動(dòng)顯著下調(diào)SHR-EX組α1c表達(dá)量（＜0.05）。但在正常血壓組，運(yùn)動(dòng)顯著升高而非抑制α1c亞基表達(dá)（＜0.05）。分別選用α和β1亞基特異性抗體檢測到125 kDa和28 kDa的蛋白表達(dá)（圖4-B、4-D）。BKCa通道α亞基在各組間表達(dá)無顯著差異。與WKY-SED組相比，SHR-SED組β1亞基蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05）。因此，高血壓β1/α比值呈現(xiàn)顯著性上升（＜0.05）。提示，高血壓時(shí)β1亞基上調(diào)較α亞基更為顯著。經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY-EX組β1亞基表達(dá)發(fā)生上調(diào)（＜0.05），而SHR-EX組較SHR-SED組β1亞基表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，β1/α比值亦呈顯著下降（＜0.05）。

圖 4 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈LTCC和BKCa通道亞基蛋白表達(dá)

Figure 4. Protein Expression of LTCC and BKCaChannel Subunits in Mesenteric Arteries from Four Groups

注：A為各組腸系膜動(dòng)脈LTCC通道α1c亞基及內(nèi)參β-actin的Western blot條帶；B為各組腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基及內(nèi)參β-actin的Western blot條帶；C為各組腸系膜動(dòng)脈α1c亞基蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)；D為各組腸系膜動(dòng)脈α和β1亞基蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)（各組n=6）。

qPCR結(jié)果如圖5-A所示，WKY-SED、WKY-EX和SHR-SED組間大鼠LTCC通道α1c亞基mRNA表達(dá)無顯著差異（＞0.05）；但有氧運(yùn)動(dòng)顯著下調(diào)SHR-EX組α1cmRNA表達(dá)量（＜0.05）。BKCa通道α亞基mRNA在各組間表達(dá)無顯著差異。與WKY-SED組相比，WKY-EX和SHR-SED組β1亞基mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（＜0.05）。而經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組較SHR-SED組β1亞基mRNA表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)（＜0.05）。

2.5 運(yùn)動(dòng)對高血壓腸系膜動(dòng)脈CACNA1C和KCNMB1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響

采用亞硫酸氫鹽測序法檢測了LTCC通道α1c基因（）和BKCa通道β1基因（）啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，進(jìn)一步探究高血壓引起腸系膜動(dòng)脈離子通道重塑及運(yùn)動(dòng)改善LTCC和BKCa通道功能的潛在表觀遺傳機(jī)制。

如圖5-B所示，本研究分別選取了位于4號(hào)染色體基因啟動(dòng)子區(qū)538 bp長度、包含11個(gè)CpG位點(diǎn)的CpG島區(qū)（216566309-216566846），以及位于10號(hào)染色體上的基因啟動(dòng)子區(qū)402 bp長度，包含7個(gè)CpG位點(diǎn)的區(qū)域（18911664-18912065）的甲基化水平進(jìn)行了分析。

結(jié)果顯示（圖5-C、5-D），WKY-SED、WKY-EX和SHR-SED組腸系膜動(dòng)脈基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度未發(fā)現(xiàn)顯著改變；運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著上調(diào)，發(fā)生超甲基化（＜0.05）。對于基因，正常血壓時(shí)，WKY-EX組腸系膜動(dòng)脈基因啟動(dòng)子區(qū)顯著去甲基化 （＜0.05）。同時(shí)，與WKY-SED組相比，SHR-SED組基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平亦發(fā)生顯著降低（＜0.05）；但有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度上調(diào)，表現(xiàn)為超甲基化（＜0.05）。

2.6 運(yùn)動(dòng)經(jīng)miR-328靶向調(diào)控LTCC通道α1c亞基表達(dá)

此部分本研究首先對各組miR-328表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，正常血壓時(shí)，WKY-EX和SHR-SED組腸系膜動(dòng)脈miR-328表達(dá)均顯著降低（＜0.05）。有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組miR-328表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05）（圖6-A）。這與LTCC通道α1c亞基蛋白表達(dá)結(jié)果相反，提示，運(yùn)動(dòng)可能經(jīng)miR-328靶向調(diào)控LTCC通道α1c亞基表達(dá)；后續(xù)進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，對腸系膜動(dòng)脈VSMC分離培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染干預(yù)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-328的靶向作用。

如圖6-B所示，采用免疫熒光激光共聚焦成像，用平滑肌特異性肌動(dòng)蛋白α-actin對培養(yǎng)后的VSMC進(jìn)行鑒定，VSMC骨架蛋白α-actin清晰可變，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC，純度達(dá)到95%，無雜細(xì)胞污染，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。α1c亞基mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)染后48 h無顯著變化。而在轉(zhuǎn)染miR-328 mimic 48 h后α1c亞基蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-328 inhibitor組α1c亞基蛋白表達(dá)稍上調(diào)（＞0.05）（圖6-D）。

圖5 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈LTCC、BKCa通道亞基mRNA及DNA甲基化水平

Figure 5. mRNA and DNA Methylation Levels of LTCC and BKCaChannel Subunits from Four Groups

注：A為各組腸系膜動(dòng)脈LTCC通道α1c亞基、BKCa通道α和β1亞基mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)（各組n=6）；B為、基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島區(qū)圖譜；C為各組、基因CpG位點(diǎn)DNA甲基化情況，每個(gè)基因選取10個(gè)克隆進(jìn)行測序，其中黑色圈代表甲基化位點(diǎn)，白色圈代表未甲基化位點(diǎn)；D為、啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化百分比水平統(tǒng)計(jì)（各組n=6）。

圖6 VSMC轉(zhuǎn)染后LTCC通道α1c亞基mRNA及蛋白表達(dá)

Figure 6. mRNA and Protein Expression of LTCC α1cSubunit After Transfection in VSMC

注：A為各組大鼠腸系膜動(dòng)脈miR-328表達(dá)統(tǒng)計(jì)（各組n=6）；B為平滑肌特異性肌動(dòng)蛋白α-actin熒光標(biāo)記的VSMC代表圖；C為VSMC轉(zhuǎn)染miR-328 mimic或inhibitor 48 h后LTCC通道α1c亞基mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)；D為VSMC轉(zhuǎn)染miR-328 mimic或inhibitor 48 h后LTCC通道α1c亞基蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)（各組n=6），代表培養(yǎng)的細(xì)胞批數(shù)。&表示與NC相比，＜0.05有顯著性差異。

3 討論

本研究結(jié)果表明，規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，引起β1亞基啟動(dòng)子區(qū)甲基化，調(diào)控miR-328在轉(zhuǎn)錄后靶向抑制α1c亞基表達(dá)，是運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa和LTCC通道功能重構(gòu)的表觀遺傳機(jī)制之一。

有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低高血壓大鼠血壓和心率，運(yùn)動(dòng)的降壓作用涉及多種機(jī)制。例如，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能，降低交感神經(jīng)興奮性，降低心率，從而降低心輸出量[35]；此外，交感神經(jīng)興奮性降低，迷走神經(jīng)興奮性增加，使得外周小動(dòng)脈痙攣得到緩解，達(dá)到降壓作用[14]；有氧運(yùn)動(dòng)降壓的其他外周機(jī)制還包括外周血管阻力下降[7]，內(nèi)皮功能改善[34]等。而運(yùn)動(dòng)可逆轉(zhuǎn)高血壓引起的VSMC離子通道的病理重構(gòu)，改善動(dòng)脈功能，亦會(huì)對血壓降低起到積極作用[31,32]。

LTCC是存在于VSMC上的一種主要鈣通道，經(jīng)LTCC內(nèi)流的Ca2+是胞漿中Ca2+濃度升高的主要途徑，也是引起VSMC收縮的基礎(chǔ)。多年研究證實(shí)，VSMC膜上LTCC通道上調(diào)被公認(rèn)為是高血壓的一個(gè)標(biāo)志性特征[8,29,37]。本研究中，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式檢測到，LTCC通道電流在高血壓時(shí)顯著增大，這與以往的研究是一致的。高血壓時(shí)，VSMC膜上LTCC上調(diào)，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起外周阻力和血管收縮反應(yīng)增大[8,37]。此外，血壓與體內(nèi)VSMC的LTCC通道數(shù)量呈高度正相關(guān)。高血壓時(shí)L鈣通道電流的這種增大被證明是由于其通道本身上調(diào)[38]以及膜電位的去極化[12]導(dǎo)致的。事實(shí)上，高血壓動(dòng)物血管LTCC通道功能上調(diào)極大程度是通道表達(dá)的增加。免疫印跡結(jié)果亦表明，與正常血壓組相比，高血壓大鼠動(dòng)脈LTCC通道亞基α1c顯著增加。此外，VSMC的去極化，是血管對血壓升高的基本反應(yīng)，同樣是α1c亞基上調(diào)的主要刺激之一。本研究中，高血壓組腸系膜動(dòng)脈VSMC靜息Em呈顯著去極化狀態(tài)，從而增大了Ca2+電流密度。經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組血壓降低，靜息Em超級化，伴隨著LTCC通道電流、α1c亞基表達(dá)下調(diào)。BKCa通道是VSMC上表達(dá)最廣泛的一類K+通道，其生理功能主要是通過負(fù)反饋機(jī)制來對抗管腔內(nèi)壓升高引起的肌源性收縮，從而確保重要器官穩(wěn)定的血流灌注[30]。本研究結(jié)果證明，SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌全細(xì)胞IK電流增加；BKCa通道特異性阻斷劑IbTX作用后顯示，BKCa電流在高血壓時(shí)亦顯著上調(diào)。以往的研究亦表明，SHR動(dòng)脈平滑肌BKCa通道功能增強(qiáng)[26,31]，而運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa通道的功能上調(diào)。值得注意的是，在正常血壓組，有氧運(yùn)動(dòng)引起SBP小幅度的下降，但卻引起WKY-EX組LTCC和BKCa通道功能上調(diào)，與運(yùn)動(dòng)在高血壓時(shí)的作用相反。提示，在正常血壓時(shí)，運(yùn)動(dòng)引起離子通道的重塑是獨(dú)立于血壓變化的一種改變。

上文已經(jīng)提到，BKCa通道可在局部[Ca2+]i濃度升高條件下激活，即近膜區(qū)鈣火花能夠活化其附近簇狀分布的BKCa通道開放；可以說，鈣火花的活動(dòng)改變是BKCa通道活動(dòng)改變的原因之一。鈣火花是肌質(zhì)網(wǎng)上單個(gè)RyR自發(fā)或者協(xié)同開放所產(chǎn)生的鈣釋放事件光學(xué)記錄[27]。鈣火花釋放可使膜超級化，其結(jié)果是關(guān)閉電壓依賴鈣通道，阻止外鈣內(nèi)流，可以說鈣火花具有強(qiáng)有力的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，其凈效應(yīng)是降低全細(xì)胞Ca2+濃度，導(dǎo)致血管舒張[27]。因此，本研究采用活細(xì)胞實(shí)時(shí)鈣離子成像技術(shù)結(jié)合全內(nèi)反射熒光（TIRF）系統(tǒng)捕捉各組腸系膜動(dòng)脈VSMC鈣火花信號(hào)。TIRF系統(tǒng)的優(yōu)勢在于非常適合檢測細(xì)胞膜表面或膜下200 nm區(qū)域的信號(hào)，同時(shí)，TIRF系統(tǒng)幾乎沒有任何背景熒光干擾，能在最大程度上提高圖像的信噪比，優(yōu)于傳統(tǒng)激光共聚焦系統(tǒng)采集到的鈣火花圖像。SHR腸系膜動(dòng)脈VSMC鈣火花幅值顯著增大，有氧運(yùn)動(dòng)后幅值下降。除鈣火花外，BKCa通道固有生物物理特性、通道蛋白表達(dá)的改變都可引起高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa通道電流增大。蛋白免疫印跡分析BKCa通道β1亞基在高血壓大鼠中的表達(dá)顯著增多。單通道結(jié)果顯示，高血壓時(shí)BKCa通道的開放概率顯著增加，這與β1亞基表達(dá)上調(diào)是一致的。因此，SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道功能增加，首先歸因于鈣火花幅值的升高，其次單通道活動(dòng)增強(qiáng)、β1亞基表達(dá)上調(diào)也是其重要原因，而有氧運(yùn)動(dòng)可逆轉(zhuǎn)高血壓引起的BKCa的病理性代償上調(diào)。

綜上所述，高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈α1c亞基表達(dá)上調(diào)，LTCC通道電流增大，VSMC胞內(nèi)鈣濃度升高；為代償胞內(nèi)升高的Ca2+，鈣火花釋放增加、β1亞基表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引起B(yǎng)KCa通道功能代償性增強(qiáng)。本研究證實(shí)了有氧運(yùn)動(dòng)可逆轉(zhuǎn)高血壓VSMC離子通道重構(gòu)，下調(diào)高血壓腸系膜動(dòng)脈α1c和β1亞基表達(dá)，從而降低LTCC通道電流，延緩BKCa通道的病理性代償增強(qiáng)，誘導(dǎo)動(dòng)脈平滑肌功能恢復(fù)。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的新興和發(fā)展，表觀遺傳學(xué)理論和技術(shù)已成為心血管領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)之一，而環(huán)境、飲食、藥物、體力活動(dòng)等因素均可通過對基因的表觀遺傳修飾影響基因表達(dá)[3]。因此，表觀遺傳是環(huán)境-遺傳物質(zhì)間相互作用的結(jié)果，也是環(huán)境-基因之間的橋梁，并且把基因型和表型密切聯(lián)系在一起[36]。DNA甲基化是最先發(fā)現(xiàn)研究最廣泛的表觀遺傳修飾，可從轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控下游功能蛋白，關(guān)閉某些基因的活性，甲基化位點(diǎn)亦可隨DNA的復(fù)制而遺傳[21]，而啟動(dòng)子DNA超甲基化或甲基化水平升高，通常能夠抑制基因轉(zhuǎn)錄，直接沉默相關(guān)基因[21]。規(guī)律運(yùn)動(dòng)作為一種良性刺激，可使得DNA啟動(dòng)子內(nèi)甲基化狀態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而影響血管功能調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，改善血管功能。本研究中，高血壓時(shí)基因啟動(dòng)子區(qū)呈去甲基化，有氧運(yùn)動(dòng)可引起啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平升高，這與β1亞基mRNA、蛋白表達(dá)以及功能改變的結(jié)果是一致的。因此，β1亞基啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在BKCa通道功能調(diào)控中起重要作用。以往也有研究證實(shí)，未懷孕的羊子宮動(dòng)脈BKCaβ1亞基啟動(dòng)子區(qū)Sp-1轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)高度甲基化，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，減弱BKCa通道活動(dòng)[11]。對于LTCC α1c亞基，高血壓未調(diào)控啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，但運(yùn)動(dòng)引起高血壓基因啟動(dòng)子區(qū)超甲基化，這也是運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致高血壓腸系膜動(dòng)脈α1c亞基mRNA、蛋白表達(dá)及功能下調(diào)的原因之一。CpG位點(diǎn)的甲基化受到空間和時(shí)間因素的變化性影響，空間上包括組織或細(xì)胞的特異性，而時(shí)間上年齡、疾病、環(huán)境調(diào)控，都會(huì)引起有差異的甲基化水平[24]。因此，高血壓或運(yùn)動(dòng)對基因的特異性影響可能是造成和甲基化水平差異的原因，但具體機(jī)制還需深入研究。而機(jī)體新陳代謝的改變被認(rèn)為是引起表觀修飾變化的基礎(chǔ)，例如，三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸是催化多種甲基化反應(yīng)酶的底物和輔酶因子[13]。

除DNA甲基化外，本研究還探討了miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。miRNA是一類不含遺傳信息的非編碼小RNA，主要對mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)向調(diào)節(jié)[17]。由于miRNA可以內(nèi)源性地同時(shí)作用于與高血壓有關(guān)的靶基因，因此，miRNA為全面深入了解高血壓的表觀遺傳發(fā)病機(jī)制提供了很好的切入點(diǎn)。血管中表達(dá)有多種特異性的miRNA，其在血管的正常生長發(fā)育過程中必不可少[4]。本研究中，檢測到各組腸系膜動(dòng)脈miR-328表達(dá)與LTCC α1c亞基蛋白表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，肺動(dòng)脈高壓時(shí)，miR-328可通過結(jié)合LTCC α1c亞基3’-UTR區(qū)，抑制α1c亞基表達(dá)，從而減弱了肺動(dòng)脈對KCl的反應(yīng)[16]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，miR-328可靶向抑制α1c亞基表達(dá)，調(diào)控腸系膜動(dòng)脈LTCC功能。此外，miR-328還可靶向作用于IGF-1R，引起肺動(dòng)脈血管平滑肌發(fā)生細(xì)胞凋亡[16]。有報(bào)道，miR-210可靶向結(jié)合10-11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶-1（TET-1）mRNA 3’-UTR區(qū)，抑制TET-1表達(dá)，導(dǎo)致BKCaβ1亞基去甲基化過程受阻，β1亞基表達(dá)下調(diào)，子宮動(dòng)脈BKCa通道功能受損[18]?？梢?，miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可靶向作用于多種基因，調(diào)節(jié)動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和功能。

有研究表明，規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)作為一種環(huán)境表觀遺傳調(diào)制器，可在不影響DNA編碼的前提下，通過誘導(dǎo)表觀遺傳修飾調(diào)控高血壓相關(guān)基因的表達(dá)水平，在改善心血管功能中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過膜片鉗技術(shù)、鈣離子成像、結(jié)合分子生物學(xué)檢測、亞硫酸氫鹽測序、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染等技術(shù)，從LTCC、BKCa通道全細(xì)胞電流、鈣火花、BKCa單通道電流、通道亞基mRNA、蛋白表達(dá)，證明了有氧運(yùn)動(dòng)可有效改善高血壓腸系膜動(dòng)脈平滑肌LTCC和BKCa通道功能。并且，以DNA甲基化和miRNA為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)β1亞基啟動(dòng)子區(qū)甲基化，miR-328靶向抑制α1c亞基表達(dá)，是運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa和LTCC通道功能重構(gòu)的表觀遺傳機(jī)制之一，為理解高血壓發(fā)病的表觀遺傳機(jī)制以及高血壓藥物治療新靶點(diǎn)的尋找提供了重要證據(jù)。

4 結(jié)論

規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低SHR血壓，引起β1亞基啟動(dòng)子區(qū)甲基化，調(diào)控miR-328在轉(zhuǎn)錄后靶向抑制α1c亞基表達(dá)，是運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈BKCa和LTCC通道功能重構(gòu)的表觀遺傳機(jī)制之一。

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Epigenetic Regulation of Exercise-improved LTCC and BKCaChannels Function in Hypertension Mesenteric Arteries

ZHANG Yan-yan, XU Zhao-xia, CHEN Yu, LI Shan-shan, SHI Li-jun

Beijing Sport University, Beijing 100084, China.

Objective: To investigate the epigenetic mechanism of the voltage-gated L-type Ca2+channel (LTCC) and the large-conductance Ca2+-activated K+channel (BKCa) function in mesenteric arterial myocytes improved by regular aerobic exercise in hypertension. Methods: 12-week-old male SHR and WKY rats were randomly assigned to sedentary and exercise training groups, respectively. Exercise groups were performed a moderate-intensity treadmill running. After 12 weeks, patch clamp study, Ca2+image, Western blot, qPCR, bisulfite sequencing PCR were used to detect the LTCC and BKCachannel currents, BKCasingle channel gating properties, Ca2+spark, mRNA and protein expression of LTCC α1ctogether with BKCaα and β1 subunits, DNA methylation levels of α1cand β1 gene promoter region, miR-328 expression. In vitro experiment，miR-328 mimic and miR-328 inhibitor were transfected into cultured arterial myocytes to make miR-328 overexpressing or silencing, the mRNA and protein levels of α1csubunits were determined after 48 h transfection. Results: 1) After aerobic exercise, SBP in both exercise groups of WKY and SHR were significantly lower than that of their sedentary counterparts. 2) Exercise normalized the increased LTCC and BKCacurrent density of mesenteric arterial myocytes in SHR. 3) Exercise attenuated the increased single BKCachannel open probability () and the amplitude of Ca2+spark in hypertension. 4) Exercise inhibited the upregulated mRNA and protein expression of BKCaβ1 subunit in mesenteric arteries from SHR; β1 gene promoter was demethylation in hypertension, exercise increased the methylation level at β1 gene promoter of SHR. 5) The protein expression of LTCC α1csubunit was significantly increased in SHR, while decreased by exercise; the expression of miR-328 in mesenteric arteries was highly negative correlation with α1csubunit. 6) The miR-328 overexpression by transfecting miR-328 mimic decreased α1csubunit protein level significantly, while miR-328 inhibitor made α1csubunit a slight increase. Conclusions: Regular aerobic exercise efficiently reduces blood pressure of SHR, enhances β1 gene promoter methylation, mediates miR-328 inhibiting the α1cexpression at post-transcriptional level, which might be the epigenetic mechanism underlying exercise-improved BKCaand LTCC channels function in mesenteric arteries of hypertension.

G804.7

A

1000-677X(2018)11-0039-11

10.16469/j.css.201811004

2018-08-07；

2018-11-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31771312);北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(5172023);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2018XS004)。

張嚴(yán)焱,女,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué),E-mail:15210574247@163.com。

石麗君,女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué),E-mail:l_j_shi72@163.com。