鐘 翔，楊 雪，2，涂月菊，李 怡，張 萍，鄒玉蓉，李貴森，王 莉

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610072；2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

腎纖維化是各種慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展至終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的共同表現(xiàn)，是影響患者腎功能和腎臟預(yù)后的主要指標(biāo)。目前臨床實(shí)踐中仍然缺乏有效的腎臟纖維化干預(yù)措施。WNT1誘導(dǎo)信號通路蛋白1(WNT1-inducible signaling pathway protein-1，WISP-1)也稱為CCN4，是一種富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽。研究證實(shí)，WISP-1通過增強(qiáng)細(xì)胞粘附、促進(jìn)細(xì)胞遷移和刺激細(xì)胞增殖等方法[1，2]，參與肺臟[3]，心臟[4]和肝臟[5]等器官的纖維化，但它在腎臟纖維化中的具體作用仍然未知。因此，本研究旨在探討WISP-1在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎臟纖維化中的作用，為腎纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1動物模型制備與干預(yù)2015年9月至2017年6月體重20～25 g的雄性C57BL/6清潔小鼠(10周)購自四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。首先參考課題組以前實(shí)驗(yàn)方法制作UUO模型[6]。將5 μg的小鼠WISP-1/CCN4親和純化多克隆抗體(Pab)(AF1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)和5 μg的小鼠WISP-1/CCN4單克隆抗體(Mab)(MAB1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)通過腹腔注射到UUO小鼠作為處理組(UUO+Ab)；同時將純化大鼠IgG(6-001-A，R&D Systems，Minneapolis，MN，美國)注射入UUO小鼠腹腔作為對照組處理組(UUO+IgG)；單純行UUO手術(shù)小鼠作為模型組(UUO)；隨機(jī)選擇年齡體重匹配正常小鼠作為正常組(Normal)；每組均為10只。將所有小鼠飼養(yǎng)于控制環(huán)境條件下(23 ℃)具有12小時明暗周期的房間中，在UUO手術(shù)后第7天麻醉處死所有小鼠并收集梗阻側(cè)腎組織。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號：2013自科(04)號)。

1.2腎臟病理和免疫組織化學(xué)染色在UUO手術(shù)后第7天處死小鼠后，取出梗阻側(cè)腎臟并用4%多聚甲醛固定，然后包埋在石蠟中。制備3 μm的腎臟切片，并使用蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色，高碘酸-雪弗(periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson三色染色評估腎臟病理學(xué)變化。免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色在常規(guī)脫蠟水化后，使用高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗包括抗WISP-1 (ab178547，Abcam，劍橋，英國)、抗膠原蛋白I(抗 Collagen I，ab34710，Abcam，劍橋，英國)4 ℃過夜后，室溫孵育二抗1小時，使用DAB進(jìn)行顯色，顯微鏡下控制顯色時間。靶蛋白的陽性染色區(qū)域使用ImageJ軟件(NIH)測量，結(jié)果表示為檢測區(qū)域的百分比。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡分析在液氮中研磨小鼠腎臟組織后，使用RIPA緩沖液在冰上裂解組織，超聲后13000×g 10分鐘離心提取上清液。蛋白樣品電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1小時。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下二抗孵育2小時。ECL試劑顯影，并用Image Quant LAS4000微型系統(tǒng)捕獲。使用ImageJ軟件定量分析蛋白質(zhì)印跡的變化。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用單因素方差分析及SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1常規(guī)病理染色顯示抗WISP-1治療改善UUO小鼠腎組織纖維化的形態(tài)學(xué)改變常規(guī)病理染色包括HE，PAS和Masson三色染色顯示對比正常小鼠組，UUO組和UUO + IgG組小鼠腎組織出現(xiàn)不同程度腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和膠原纖維及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，表明造模成功。在WISP-1抗體干預(yù)后，UUO + Ab組上述病理變化顯著減輕(圖1)，表明抗WISP-1治療從腎組織形態(tài)學(xué)上改善UUO小鼠腎組織纖維化。

2.2免疫組化染色顯示抗WISP-1治療減輕UUO小鼠腎組織腎纖維化的表達(dá)采用IHC來檢測各組小鼠腎臟WISP-1和纖維化標(biāo)志物膠原蛋白I(Collagen I)的表達(dá)。如圖2a所示，在UUO組和UUO + IgG組的腎組織中，WISP-1主要在腎小管間質(zhì)表達(dá)，少量在腎小球中表達(dá)，UUO + Ab小鼠腎組織WISP-1表達(dá)明顯降低，表明抗WISP-1抗體能有效阻斷WISP-1在腎臟表達(dá)。同時抗WISP-1治療后Collagen I的染色強(qiáng)度顯著降低。進(jìn)一步采用半定量分析，結(jié)果顯示抗WISP-1治療能有效降低WISP-1和腎組織纖維化，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2b)。

圖1 各組腎組織常規(guī)病理染色(×400)

圖2 各組腎組織免疫組織化學(xué)WISP-1和Collagen I染色 a：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標(biāo)Collagen I的免疫組織化學(xué)染色(×400)；b：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標(biāo)Collagen I的免疫組織化學(xué)染色半定量結(jié)果比較。與Normal組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與UUO組比較，#P < 0.05

2.3WB顯示抗WISP-1治療降低UUO小鼠腎組織腎纖維化的蛋白表達(dá)本研究同時提取了各組小鼠腎組織蛋白質(zhì)來檢測WISP-1和腎臟纖維化指標(biāo)Collagen I的表達(dá)水平。如圖3 a所示，抗WISP-1抗體處理組后WISP-1 蛋白水平降低，表明抗WISP-抗體成功抑制UUO小鼠梗阻側(cè)腎臟中的WISP-1表達(dá)。而纖維化標(biāo)志物Collagen I的蛋白表達(dá)在WISP-1抗體干預(yù)處理后也顯著降低。相反，UUO+IgG組的纖維化標(biāo)志物和WISP-1表達(dá)相比UUO組無明顯改變。半定量分析各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3b)。

圖3 各組腎組織蛋白質(zhì)免疫印跡分析 a：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標(biāo)Collagen I的蛋白質(zhì)免疫印跡；b：各組腎組織的WISP-1和纖維化指標(biāo)Collagen I的蛋白質(zhì)免疫印跡半定量結(jié)果比較。與Normal組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與UUO組比較，##P < 0.01

3 討論

無論CKD最初病因是什么，纖維化都被認(rèn)為是各種CKD進(jìn)展至ESRD的共同通路。腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展極其復(fù)雜，是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在損傷的腎臟組織中累積并形成永久性瘢痕組織，最終導(dǎo)致腎功能喪失[7]。

研究表明Wnt/β-catenin信號通路在纖維化中起著重要作用[8]。WISP-1是Wnt/β-catenin信號通路的下游分子，，在心臟、腎臟、肺臟、胎盤、卵巢、小腸、脾和腦等多種組織中表達(dá)[9]。研究報道，在冠狀動脈左前降支永久性閉塞小鼠模型中，WISP-1在邊界區(qū)和非缺血性遙遠(yuǎn)區(qū)上調(diào)，并刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖[4，10]。通過激活αvβ5整合素，PI3K，Akt和NF-κB通路，WISP-1促進(jìn)了滑膜纖維化[11]。研究表明，WISP-1增強(qiáng)了肝星狀細(xì)胞的增殖，阻斷WISP-1后，肝臟中膠原的形成和α-SMA的表達(dá)明顯減少[5，12]。此外，在肺纖維化小鼠模型和特發(fā)性肺纖維化患者中，肺泡上皮II型細(xì)胞中WISP-1的表達(dá)增加，并且特異于WISP-1的中和單克隆抗體減少了纖維化特征性基因的表達(dá)[3]。我們的前期研究首次發(fā)現(xiàn)[13]，WISP-1的表達(dá)不僅在TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞纖維化和UUO小鼠模型中升高，而且在CKD患者包括局灶增生性IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)，局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，F(xiàn)SGS)和糖尿病性腎病(diabetic kidney disease，DKD)的腎臟組織和血清中明顯升高。然而，WISP-1在腎臟纖維化中的功能尚未有研究報道。因此，本研究采用市售抗WISP-1抗體干預(yù)WISP-1在UUO模型小鼠體內(nèi)表達(dá)，探索抗WISP-1治療是否影響UUO小鼠腎臟纖維化。

UUO模型是目前研究腎小管間質(zhì)纖維化最常用的動物模型，以進(jìn)行性小管間質(zhì)纖維化為特征，梗阻時間越長，腎間質(zhì)纖維化的程度越嚴(yán)重[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，無論是在組織學(xué)上還是在蛋白的表達(dá)上，UUO小鼠在術(shù)后第7天均出現(xiàn)顯著的纖維化表現(xiàn)，表明UUO模型小鼠造模成功。

本研究采用市售抗WISP-1抗體通過腹腔注射方法干預(yù)WISP-1在UUO模型小鼠體內(nèi)表達(dá)。利用WB、IHC證實(shí)UUO組及UUO+IgG組小鼠腎臟中的WISP-1表達(dá)增加，使用抗WISP-1抗體處理后，UUO+Ab組WISP-1的表達(dá)明顯降低，證實(shí)抗WISP-1治療可以成功抑制UUO小鼠腎臟WISP-1表達(dá)；更重要的是，抗WISP-1抗體組UUO小鼠的腎臟病理、纖維化程度及重要纖維化指標(biāo)Collagen I均比UUO組和UUO + IgG組明顯減輕。這些重要的研究結(jié)果表明，通過WISP-1中和抗體的干預(yù)可以減輕UUO小鼠中的腎纖維化，提示W(wǎng)ISP-1在腎臟纖維化中起致病作用。

本研究成功建立了UUO纖維化小鼠模型，并成功通過抗WISP-1抗體抑制WISP-1在UUO小鼠體內(nèi)表達(dá)。我們研究結(jié)果表明WISP-1在腎纖維化中扮演了促進(jìn)作用，而抗WISP-1抗體治療可以通過凋亡改善腎纖維化。本研究為腎臟纖維化的治療提供了新的靶點(diǎn)和途徑。