張 歡， 趙赟鑫， 李昭瑩， 田 露， 鄧百萬(wàn)

(1.陜西省漢中市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，陜西漢中 723000； 2.漢中植物研究所，陜西漢中 723000； 3.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723000； 4.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

以植物內(nèi)生真菌作為藥源，其來(lái)源不會(huì)枯竭。從可持續(xù)發(fā)展的角度來(lái)看，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇可望解決市場(chǎng)價(jià)格昂貴、供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，并且對(duì)于研究植物來(lái)源天然藥物的新生產(chǎn)途徑以及瀕危藥用植物的保護(hù)，具有十分重要的意義[1]。

近些年來(lái)，紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展很快，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究報(bào)道逐漸增多，其關(guān)鍵問(wèn)題在于紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)量的提高。因?yàn)橥ㄟ^(guò)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)至少需要達(dá)到毫克級(jí)，但目前該方法產(chǎn)量一般只有幾百微克，主要是由于缺乏高產(chǎn)、穩(wěn)定的適于發(fā)酵的工業(yè)菌株，以及發(fā)酵條件的不合理而限制了單位發(fā)酵液中紫杉醇的含量[2]。

pH值除了直接影響發(fā)酵過(guò)程中的各種反應(yīng)速率外，還能夠改變發(fā)酵液的化學(xué)性質(zhì)，間接影響目的產(chǎn)物的生物合成和菌體的生長(zhǎng)。郭曉恒等對(duì)SPH-4誘變后菌株SPH-W2的生理特性進(jìn)行考察，初始pH值為7.0時(shí)，代謝液中紫杉醇檢出量較高[3]。

溫度是保證酶活性的重要條件，溫度升高，生長(zhǎng)代謝加快，反應(yīng)速率加大，生產(chǎn)期提前，但溫度越高，酶失活越快，發(fā)酵周期縮短，菌體易于衰老，從而影響目的產(chǎn)物的最終產(chǎn)量。劉君對(duì)4株菌進(jìn)行生理特性考察，發(fā)現(xiàn)菌株1015和菌株1006在30 ℃和25 ℃時(shí)生長(zhǎng)較好，而菌株1002和菌株1025在 25 ℃和20 ℃時(shí)生長(zhǎng)較好，當(dāng)溫度為35 ℃和10 ℃時(shí)，4株菌菌絲生長(zhǎng)都很緩慢，有的幾乎停止生長(zhǎng)[4]。

此外，接種量的大小、培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短與菌種特性、發(fā)酵條件等有關(guān)，不同的微生物其發(fā)酵的接種量和培養(yǎng)時(shí)間是不同的。孟永宏對(duì)植物內(nèi)生真菌Y3菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明以培養(yǎng)30 h為接種齡和2%的接種量時(shí)紫杉醇產(chǎn)量最高[5]。

本研究采用筆者所在課題組自行分離的紫杉醇高產(chǎn)菌株MetarhiziumanisopliaeLB-10[6]，在優(yōu)化碳源、氮源、微量元素組成、濃度及其配比的基礎(chǔ)上[7]，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅豆杉內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10，分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，水1.0 L，pH值6.0～8.0；發(fā)酵液(g/L)：葡萄糖50.0 g/L，NH4NO36.0 g/L，無(wú)水MgSO40.3 g/L，KH2PO40.5 g/L，維生素B15.0×10-2g/L。

1.1.3 藥品與試劑 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)、乙酸乙酯、甲醇、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀(LC 2000)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV-10，IKA)、電子天平(TB-214)、雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-2102C)、人工氣候箱(LRH-250-G-S)、數(shù)控超聲波清洗儀(KQ-5200-DE)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法：在新鮮斜面上取 5 mm×5 mm大小已純化的菌塊，接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng) 3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液混勻，按3%的接種量接種到裝有330 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每次提取所用發(fā)酵液的量為1 000 mL，于28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng) 10 d。

1.2.2 紫杉醇樣品的提取 對(duì)培養(yǎng)10 d的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體2個(gè)部分，菌絲用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過(guò)分液漏斗萃取，分別重復(fù)3次，合并收集到的乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過(guò)濾，濾液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，樣品用甲醇溶解并且定容至10.0 mL待測(cè)。

1.2.3 紫杉醇的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè) 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容至10.0 mL，配制成0.01～0.16 mg/mL的濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，甲醇定容至10.0 mL，從而得到母液濃度為0.4 mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL，取20.0 μL進(jìn)樣(n=5)，得到回歸方程為y=6.087 8+3 589.391 3x，r=0.999 222。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，采用外標(biāo)法測(cè)定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯抽提物中紫杉醇的含量。

色譜條件：水-甲醇-乙腈(33 ∶35 ∶32)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20.0 μL，柱溫：室溫，色譜柱：C18(4.6 mm×150 mm)。

紫杉醇含量的計(jì)算公式：發(fā)酵液中紫杉醇的含量 (μg/L)=甲醇中紫杉醇的含量(mg/mL)×溶解提取物所用甲醇的體積(mL)×106÷提取時(shí)所取發(fā)酵液的體積(mL)。

每次提取的紫杉醇均做3個(gè)平行樣，分別經(jīng)HPLC測(cè)定并通過(guò)公式計(jì)算發(fā)酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4 生物量的測(cè)定 取一定體積的發(fā)酵液離心(4 800 r/min)20 min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量，計(jì)算菌絲體生物量。

1.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.5.1 單因素試驗(yàn) 采用優(yōu)化后的發(fā)酵液培養(yǎng)，pH值7.0，接種量3%，選取不同溫度24、26、27、28、30 ℃，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，測(cè)定不同溫度對(duì)LB-10菌體紫杉醇生物合成產(chǎn)量的影響。

采用優(yōu)化后的發(fā)酵液培養(yǎng)，溫度28 ℃，接種量3%，選用不同的pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，測(cè)定不同初始pH值條件對(duì)LB-10菌體紫杉醇生物合成產(chǎn)量的影響。

采用優(yōu)化后的發(fā)酵液培養(yǎng)，溫度28 ℃，pH值7.0，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，采用不同接種量1%、3%、5%、7%、9%，考察不同接種量對(duì)LB-10菌體紫杉醇生物合成產(chǎn)量的影響。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn) 選取對(duì)紫杉醇積累有一定影響的溫度、pH值和接種量，各取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn)。

1.2.5.3 培養(yǎng)時(shí)間的研究 采用優(yōu)化后的發(fā)酵液培養(yǎng)，以紫杉醇產(chǎn)量和生物量為指標(biāo)，在發(fā)酵培養(yǎng)LB-10菌體的第4～20 d，每隔1 d對(duì)LB-10的菌絲體生物量和紫杉醇產(chǎn)量進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)和記錄，研究不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)量和代謝產(chǎn)物紫杉醇含量的影響。同時(shí)，尋找LB-10菌體發(fā)酵培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，從而確定代謝調(diào)控物質(zhì)的最佳添加時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適培養(yǎng)溫度

為了提高菌體的生長(zhǎng)速度和代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率，在發(fā)酵過(guò)程中必須選擇最合適的溫度。由圖2可知，隨著溫度的升高，紫杉醇生物合成量顯著增加，當(dāng)發(fā)酵溫度在27 ℃時(shí)，紫杉醇產(chǎn)量最高，在發(fā)酵溫度高于28 ℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，紫杉醇產(chǎn)量急劇下降。

試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)紫杉醇積累有較大影響。溫度過(guò)高，會(huì)使參與紫杉醇合成的酶活性受到抑制，或者改變菌體代謝產(chǎn)紫杉醇的合成方向，所以選用27 ℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2 初始pH值的選擇

不同種類的微生物對(duì)pH值的要求不同，即使是同一種微生物，在不同pH值環(huán)境下，代謝產(chǎn)物的合成量也不同。由圖3可知，在起始pH值為3.0時(shí)，發(fā)酵液中的菌絲體幾乎不生長(zhǎng)，紫杉醇也未能檢測(cè)到，隨著pH值的升高，紫杉醇生物合成量逐漸增加，在pH值為7.0時(shí)，紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到了最大值。繼續(xù)提高pH值，紫杉醇產(chǎn)量有所下降。

試驗(yàn)表明，pH值對(duì)紫杉醇生物合成有較大影響，由于pH值的不同，菌體代謝合成途徑也不同。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，起始pH值在中性條件下對(duì)菌絲體大量合成積累紫杉醇有利，所以最佳起始pH值控制在7.0左右，可以使菌株發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的量達(dá)到最高。

2.3 接種量對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響

接種量的多少與菌種特性、發(fā)酵條件等因素有關(guān)。由圖4可知，當(dāng)接種量在3%～5%時(shí)，紫杉醇的產(chǎn)量達(dá)到了最大值；而當(dāng)接種量在1%、7%、9%時(shí)，均不同程度地限制了紫杉醇的生物合成。

試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量對(duì)紫杉醇的生物合成具有明顯的影響。當(dāng)接種量較小時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)緩慢，而菌絲體增殖消耗了大量培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，限制了后期紫杉醇的生物合成；當(dāng)接種量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致菌絲體生長(zhǎng)速度過(guò)快，使發(fā)酵培養(yǎng)基過(guò)于稠厚，導(dǎo)致發(fā)酵瓶?jī)?nèi)溶氧量不足，菌絲體過(guò)早地衰老，進(jìn)而影響紫杉醇的生物合成。

同時(shí)，在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，接種量的大小對(duì)菌絲體生物量的影響不大。因此，接種量在3%～5%時(shí)有利于紫杉醇的生物合成，由于在適當(dāng)范圍內(nèi)，采用較大接種量能夠使發(fā)酵時(shí)間縮短，所以選擇5%的接種量作為最佳接種量。

2.4 發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

以上分析了發(fā)酵條件各組分及其不同水平對(duì)發(fā)酵的單因素影響，由于各試驗(yàn)批次間差別較大，需要對(duì)各因素進(jìn)行綜合考察，才能確定較優(yōu)的工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過(guò)多個(gè)因素的分析得到各因素在整體影響中的主次關(guān)系，同時(shí)能夠獲得各因素對(duì)試驗(yàn)的影響規(guī)律，從而確定較優(yōu)的工藝條件配比。本試驗(yàn)選取對(duì)紫杉醇積累和菌體生長(zhǎng)有一定影響的溫度、pH值和接種量，各取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，結(jié)果如表2、表3所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

由表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小，得到各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響次序?yàn)锽>A>C，即pH值對(duì)產(chǎn)量影響最大，其次是溫度，最后是接種量。

由表3方差分析可知，溫度對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01(2，2)>F>F0.05(2，2)]，pH值對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響極顯著[F>F0.01(2，2)]，接種量對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響極顯著(F>F0.01(2，2))，因此所選取3個(gè)因素對(duì)紫杉醇產(chǎn)量影響均顯著。

以各因素不同水平下的均值對(duì)各水平作圖(圖5)，對(duì)于因素A和因素B，其均值水平變化是先上升，后下降，因素C的均值水平變化呈上升趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳組合為A2B2C3，即溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。因此，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析選出的最優(yōu)發(fā)酵條件是溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后發(fā)酵條件培養(yǎng)，即溫度27 ℃，pH值7.0，接種量5%。以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)LB-10菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，分別提取5次紫杉醇樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，LB-10紫杉醇含量的RSD為0.13%，說(shuō)明測(cè)定方法重現(xiàn)性好，紫杉醇含量平均值達(dá)到949.6 μg/L，產(chǎn)量比優(yōu)化后發(fā)酵液提高了11.0 μg/L。

2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間與菌種種類、特性和發(fā)酵條件等因素存在著必然的聯(lián)系。本試驗(yàn)研究不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)LB-10菌絲體生長(zhǎng)量和代謝產(chǎn)紫杉醇含量的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響

由表5可知，發(fā)酵時(shí)間在12～16 d時(shí)，紫杉醇的產(chǎn)量較高，在發(fā)酵14 d時(shí)，紫杉醇合成量達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間對(duì)目標(biāo)代謝產(chǎn)物紫杉醇的合成積累不利，而且菌絲體開(kāi)始分泌色素，對(duì)后續(xù)紫杉醇的提取也不利，所以選取最佳發(fā)酵時(shí)間為14 d，比原來(lái)的發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)4 d。

當(dāng)微生物處于一個(gè)密閉系統(tǒng)中培養(yǎng)時(shí)，可以根據(jù)微生物生長(zhǎng)速率的變化，將微生物的生長(zhǎng)分為4個(gè)不同的階段。根據(jù)表5繪制了LB-10的菌體生長(zhǎng)曲線和代謝產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量變化曲線，由圖6所示的LB-10的菌體生長(zhǎng)曲線看出，1～3 d 時(shí)處于遲緩期，4～10 d時(shí)處于對(duì)數(shù)期，11～16 d 時(shí)處于穩(wěn)定期，17～20 d時(shí)處于衰亡期。

當(dāng)微生物生長(zhǎng)到一定階段后，微生物的生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，此時(shí)進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，大量研究表明，由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期細(xì)胞已得到較好的增殖，同時(shí)，植物細(xì)胞接受代謝調(diào)控物質(zhì)的信號(hào)能力最強(qiáng)，從而使細(xì)胞得到較好的增殖，因此在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期加入代謝調(diào)控物質(zhì)的效果最好[8-11]。

結(jié)果表明，LB-10在發(fā)酵培養(yǎng)10 d時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，在此時(shí)添加前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子及抑制劑會(huì)得到較好的效果，這為后續(xù)的代謝調(diào)控研究提供了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的最佳添加時(shí)間。

3 討論與結(jié)論

在自行篩選的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的工藝條件進(jìn)行了研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)分析，確定了溫度、pH值、接種量的最適條件分別為27 ℃、7.0、5%。進(jìn)一步采用L9(34)正交試驗(yàn)分析，得到了三者在培養(yǎng)基中的最佳組合：A2B2C3，即溫度 27 ℃，pH值7.0，接種量5%，其紫杉醇平均含量達(dá)到 949.6 μg/L。

其次制作了高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌LB-10的菌體生長(zhǎng)曲線和代謝產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量變化曲線，選取發(fā)酵時(shí)間為14 d，確定LB-10在培養(yǎng)10 d時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，在此時(shí)添加前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子及抑制劑會(huì)得到較好的效果。

在發(fā)酵條件的研究中，發(fā)現(xiàn)溫度、pH值和接種量對(duì)紫杉醇的生物合成具有顯著的影響。溫度是保證酶活性的重要條件，溫度升高，生長(zhǎng)代謝加快，反應(yīng)速率加大，生產(chǎn)期提前，但溫度越高，酶失活越快，發(fā)酵周期縮短，菌體易于衰老，影響目的產(chǎn)物的最終產(chǎn)量；pH值除了直接影響發(fā)酵過(guò)程中各種反應(yīng)速率外，還可以通過(guò)改變發(fā)酵液的化學(xué)性質(zhì)，間接影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生物合成；接種量是通過(guò)改變菌體在發(fā)酵液中的初始濃度，從而改變菌體的生長(zhǎng)速率，進(jìn)而影響了紫杉醇的生物合成。因此，為了提高菌體的生長(zhǎng)速度和代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率，在發(fā)酵過(guò)程中必須選擇最合適的溫度、pH值和接種量。

經(jīng)過(guò)研究不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)量和代謝產(chǎn)紫杉醇含量的影響，得到了LB-10的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期細(xì)胞已得到較好的增殖，同時(shí)，這一時(shí)期植物細(xì)胞接受代謝調(diào)控物質(zhì)的信號(hào)能力最強(qiáng)，從而使細(xì)胞得到較好的增殖，因此在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期加入代謝調(diào)控物質(zhì)的效果最好，為后續(xù)的代謝調(diào)控研究提供了最佳添加時(shí)間。