譚妮曹驥楊春鄭海平歐超

肝癌是常見的惡性腫瘤，全球5%～28%的肝細(xì)胞癌發(fā)病可歸因于黃曲霉毒素暴露［1-2］。黃曲霉毒素暴露可增加慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)［3-5］。黃曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，AFB1）和乙型肝炎病毒感染對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展有相互協(xié)作作用，但AFB1誘發(fā)肝癌的具體機(jī)制尚未清楚?？勺兗艚拥目傮w功能是增加mRNA的多樣性，可通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路中的一些關(guān)鍵基因表達(dá)，在動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、生理代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用?？勺兗艚拥母淖兇蠖嘤牲c(diǎn)突變引起［6］，可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)同種型，對(duì)惡性腫瘤發(fā)展至關(guān)重要［7-9］，其與惡性腫瘤的關(guān)系亦成為研究熱點(diǎn)之一。本研究通過AFB1誘發(fā)大鼠肝癌模型，采用RNA-seq高通量測(cè)序探討大鼠肝臟組織的可變剪接事件，以期闡明AFB1誘發(fā)大鼠致肝癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

90只Wistar雄性大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，4周齡，體重40～60 g。單獨(dú)飼養(yǎng)于不銹鋼籠，室溫（23±1）℃，相對(duì)濕度（70±10）%。AFB1購自Sigma公司。經(jīng)4周適應(yīng)期后，將大鼠隨機(jī)分為AFB1組60只和對(duì)照組30只。AFB1組大鼠腹膜內(nèi)注射AFB1，劑量：4～7 周、9～12 周，3 次/周，每次 200 μg/kg；14～17 周、19～22 周、24～27 周、26～32 周，2 次/周，每次 100 μg/kg；34～37 周、39～42 周、44～47 周、49～52周，1次/周，每次100 μg/kg。對(duì)照組以正常飼料喂養(yǎng)。在第70周脫頸處死大鼠，取肝組織并置于液氮冷凍，用于提取肝組織RNA。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

1.2 RNA提取

采用傳統(tǒng)TRIzol（購自美國Invitrogen公司）提取RNA，130～150 mg肝組織用液氮研磨，在TRIzol裂解5 min，加氯仿靜置 2 min，12 000 r/min 4°離心 15 min，取上層液體，加入等量異丙醇靜置10 min，12 000 r/min 4°離心 15 min，75%無水乙醇清洗沉淀物 2次，12000r/min 4°離心15 min，取適量DEPC水溶解沉淀物。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA條帶，3條條帶完整即證明總RNA提取較完整。BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)OD值，OD260/OD280比值大于1.8，則說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。

1.3 RNA-seq測(cè)序

RNA-seq測(cè)序由華大基因科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行RNA測(cè)序，讀取長(zhǎng)度為90 pb。采用 FastQC工具（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）檢查 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，Tophat2（v2.0.9）將序列比對(duì)至大鼠基因組（Rnor_5.0.75）進(jìn)行序列比對(duì)，將讀段映射到參考基因組進(jìn)行剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.4 可變剪接事件鑒定

選擇目前已知的具有多種可變剪接存在的332個(gè)參考基因。采用Cufflinks（v1.3.0）軟件計(jì)算差異表達(dá)基因同種型水平的FPKM值，找出在不同大鼠肝組織中存在差異表達(dá)基因的同種型，并將其比對(duì)到DAVID數(shù)據(jù)庫，獲得GO分析生物過程（biological process，BP）功能富集。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

至第70周，AFB1組大鼠存活42只，其中發(fā)生肝癌 31只（成癌組），未發(fā)生肝癌 11只（未成癌組），對(duì)照組30只大鼠均存活。

2.2 RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量

對(duì)照組、成癌組、未成癌組序列的5′端前12個(gè)位置都有堿基（AGCT）比例不均勻的情況，故將前12個(gè)堿基切除，將剩余的78 bp用于比對(duì)分析（圖1）。3組大鼠組織中比對(duì)上的基因組序列占原始序列的比例均在85%以上，說明3組大鼠肝組織的測(cè)序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

圖1 雙端測(cè)序左側(cè)和右側(cè)序列堿基質(zhì)量得分在不同位置上的分布

2.3 基因可變剪接差異分析結(jié)果

RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示，成癌組與對(duì)照組共有37個(gè)基因的可變剪接模式存在差異，最顯著的前15類GO分析生物過程顯示，這些差異基因主要富集在刺激反應(yīng)功能和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能上（圖2A）；未成癌組與對(duì)照組共有18個(gè)基因的可變剪接模式存在較大差異，差異基因主要富集在刺激反應(yīng)功能上（圖2B）；成癌組與未成癌組有32個(gè)基因的可變剪接模式存在明顯差異，差異基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能上（圖2C）。

圖2 各組差異表達(dá)基因最顯著的前15類GO分析生物過程

2.4 成癌組中與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)有關(guān)的基因

分析成癌組細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)基因的異?？勺兗艚幽Ｊ?，發(fā)現(xiàn)7個(gè)與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的可變剪接模式發(fā)生異常，分別是KIT配體（Kitlg）、自噬關(guān)鍵基因（Becn1）、小窩蛋白-1（Cav1）、組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1（Carm1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子 1（IgfI）、視黃酸受體 γ（Rarg）、轉(zhuǎn)錄因子 E2a（Tcfe2a），其中成癌組、未成癌組和對(duì)照組IgfI、Carm1、Tcfe2a基因可變剪接模式存在顯著差異，見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織中差異基因的可變剪接模式

3 討論

RNA-seq可以準(zhǔn)確檢測(cè)基因的表達(dá)量，精確地識(shí)別基因序列變化，被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)動(dòng)植物基因組中發(fā)生的可變剪接事件［10-13］。為了研究大鼠在黃曲霉毒素作用下發(fā)生的可變剪接差異，本研究通過RNA-seq對(duì)成癌組、未成癌組及正常對(duì)照組大鼠肝組織的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)并分析其可變剪接事件?？勺兗艚邮且粋€(gè)過程，即由主要基因或者mRNA前體轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的RNA的外顯子以多種方式通過RNA剪切進(jìn)行重連，由此產(chǎn)生不同的mRNA可能被翻譯成不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，因此一個(gè)基因可能編碼多種蛋白質(zhì)，可變剪接在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組多樣性、蛋白質(zhì)組多樣性中起關(guān)鍵作用。本研究成癌組與對(duì)照組經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)可變剪接模式存在顯著差異的基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能以及刺激反應(yīng)功能中，而未成癌組與對(duì)照組差異表達(dá)基因只富集于刺激反應(yīng)功能上，說明無論大鼠肝臟組織是否發(fā)生癌變，AFB1的加入均會(huì)導(dǎo)致大鼠肝臟細(xì)胞對(duì)AFB1這一外源物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，而且這一過程涉及部分基因的可變剪接體選擇。值得注意的是，成癌組與未成癌組的差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能上，說明在AFB1作用下，大鼠是否發(fā)生肝癌病變可能主要與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)有關(guān)。

進(jìn)一步研究參與AFB1誘發(fā)大鼠肝癌過程中細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的差異基因，發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)差異基因參與了成癌組的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)過程，其中成癌組和未成癌組中IgfI基因、Carm1基因、Tcfe2a基因的可變剪接模式有明顯差異。成癌組中Tcfe2a基因的兩個(gè)同種型表達(dá)均高于對(duì)照組和未成癌組，說明大鼠在受到外源性AFB1刺激后，Tcfe2a基因的可變剪接模式改變可能與其致大鼠肝癌有關(guān)。Beck等［14］研究也表明Tcfe2a編碼的兩個(gè)可變剪接體E47和E12中，E47主要對(duì)細(xì)胞發(fā)育、增殖起作用。Matsuda等［15］研究發(fā)現(xiàn) Carm1在細(xì)胞內(nèi)的活躍程度較高，選擇性剪接對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有重要作用。Wang等［16］研究亦報(bào)道Carm1的可變剪接調(diào)節(jié)與甲基化有關(guān)。本研究中，Carm1基因的兩個(gè)同種型在成癌組中的表達(dá)高于對(duì)照組和未成癌組，提示Carm1基因的可變剪接模式可能對(duì)AFB1誘發(fā)大鼠肝癌有重要作用。Mourmouras等［17］研究發(fā)現(xiàn)Igf1不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)對(duì)膀胱癌的發(fā)生有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)Igf1基因同種型的表達(dá)在成癌組、未成癌組和對(duì)照組中亦存在差異，提示Igf1的可變剪接模式在AFB1誘導(dǎo)大鼠肝癌形成的過程發(fā)生改變，可能參與大鼠肝癌的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，IgfI、Carm1、Tcfe2a基因的可變剪接模式在大鼠不同肝組織中存在顯著差異，其可變剪接改變?cè)贏FB1暴露后的肝癌形成過程中可能發(fā)揮重要作用，這一研究結(jié)果為AFB1致肝癌的機(jī)制研究提供了新思路。