黃永周，李 漪，叢竹軍

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

乳腺炎是急性、化膿性感染導(dǎo)致乳腺管及周圍結(jié)締組織發(fā)生炎癥的疾病，以乳腺組織炎性細(xì)胞浸潤、內(nèi)皮功能受損、大量促炎細(xì)胞因子分泌為主要特點(diǎn)，是哺乳動(dòng)物泌乳期常見疾病，臨床癥狀以局部疼痛和腫塊為主，病情加重才出現(xiàn)發(fā)熱等全身癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)敗血癥，威脅患者生命安全[1]。急性乳腺炎臨床多由金黃色葡萄球菌和鏈球菌等致病菌導(dǎo)致，臨床采用抗生素治療，近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，降低了臨床治療[2]。梔子是常見的中藥，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效，具有明確的抗炎和抗內(nèi)毒素作用，但對(duì)乳腺炎是否有治療效果尚需要進(jìn)一步研究探討[3]。本研究建立脂多糖誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型，觀察梔子苷對(duì)模型乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討梔子苷在乳腺炎治療中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)的ICR雌性小鼠40只和雄性小鼠20只，8～10周齡，體重22～25 g，均購自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK (新) 2017-118]，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (新) 2017-142]，按照2∶1比例將雌性小鼠和雄性小鼠隨機(jī)合籠飼養(yǎng)，恒溫、恒濕條件下飼喂，全價(jià)日糧，自由采食和飲水，飼養(yǎng)至母鼠分娩，分娩后5～7 d開始實(shí)驗(yàn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批號(hào)：2017-0032。

1.2 主要試劑與儀器

梔子苷(純度> 99%)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；脂多糖購自北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；TRIzol購于美國Invitrogen公司；DHEA購于Fluka公司；RevertAIDTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒購于Fermentas公司；聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α和IL-1β引物序列由大連寶公司合成。紫外分光光度計(jì)購自濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DM3000生物顯微鏡購自德國徠卡公司；熒光定量PCR系統(tǒng)購自上海生物科技儀器廠；電泳儀DYY-6C購自南京萊步儀器廠；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

小鼠分娩后5～7 d，將40只ICR雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、脂多糖低劑量組(L組)、脂多糖中劑量組(M組)和脂多糖高劑量組(H組)，每組8只。模型組、L組、M組、H組四組參照文獻(xiàn)[4]的方法，取第四對(duì)乳頭消毒后乳導(dǎo)管灌注50 μg濃度為0.2 mg/mL的脂多糖，空白對(duì)照組注射等量的磷酸緩沖鹽溶液。L組、M組、H組分別注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的梔子苷，模型組和空白對(duì)照組注射等量的磷酸緩沖鹽溶液，建模后24 h處死小鼠。

1.3.2 標(biāo)本采集

采用頸椎脫臼處死小鼠，常規(guī)消毒小鼠皮膚，解剖剪剪開腹部皮膚，剝離開皮膚，充分暴露第四對(duì)乳腺組織，剝離乳腺組織并儲(chǔ)存于-80℃條件。

1.3.3 HE染色

每組取一份乳腺組織采用4%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗固定好的組織采用梯度酒精脫水，放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中直至組織呈透明狀態(tài)，隨后以石蠟包埋組織進(jìn)行切片、烘干、脫蠟，最后行蘇木精-伊紅染色和封片，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.4 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平檢測

收集100 mg乳腺組織，TRIzol提取RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)TNF-α、IL-1β、IL-6和β-actin內(nèi)參基因的引物序列：TNF-α：上游：5’-GTCTCAGC CTCTTCTCATTC-3’，下游：5’-CATAGAACTGAT GAGAGGGA-3’，產(chǎn)物長度：128 bp；IL-1β：上游：5’-AAATACCTGTGGCCTTGGGC-3’，下游：5’-CTTGG GATCCACACTCTCCAG-3’，產(chǎn)物長度：101 bp；IL-6：上游5’-GAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3’，下游：5’-CTGTGACTCCAGCTTATCTG-3’，產(chǎn)物長度：125 bp；β-actin：上游：5’-CTTCATTGACCTCAACTAC ATGG-3’，下游：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGT GAT-3’，產(chǎn)物長度：134 bp。

1.3.5 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平檢測

收集100 mg乳腺組織，按1∶9比例加入磷酸緩沖鹽溶液，碎冰上勻漿，3000 r/min離心15 min，移液槍去除上層乳白色脂肪組織，收集上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平，嚴(yán)格按照說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠乳腺組織HE染色結(jié)果

空白對(duì)照組乳腺組織腺泡上皮排列整齊，模型組乳腺腺泡結(jié)構(gòu)崩塌，乳腺上皮脫落或壞死，乳腺小葉間隔變寬度；L組、M組、H組給藥后炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，間質(zhì)水腫緩解。見圖1。

2.2 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平檢測結(jié)果比較

模型組、L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著高于空白對(duì)照組(P< 0.05)；L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于模型組(P< 0.05)；M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于L組(P< 0.05)；H組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著低于M組和L組(P< 0.05)。見表1。

注：圖中箭頭處為乳腺炎癥浸潤病變。標(biāo)尺=50 μm。圖1 小鼠乳腺組織HE染色結(jié)果(× 200)Note. Arrowheads indicate the infiltrative lesion of mastitis. Bars=50 μm.Figure 1 Histological changes in the mouse mammary gland tissues.HE staining

表1 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平±s，n=7)

注：與空白對(duì)照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與L組相比，△P< 0.05；與M組相比，&P< 0.05。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the L group,△P< 0.05. Compared with the M group,&P< 0.05.

表2 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平±s，n=7)

注：與空白對(duì)照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與L組相比，△P< 0.05；與M組相比，&P< 0.05。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the L group,△P< 0.05. Compared with the M group,&P< 0.05.

2.3 乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平

模型組、L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著高于空白對(duì)照組(P< 0.05)；L組、M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于模型組(P< 0.05)；M組和H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于L組(P< 0.05)；H組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著低于M組和L組(P< 0.05)。見表2。

3 討論

研究乳腺炎需要規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型，有報(bào)道顯示奶牛、奶山羊、兔、小鼠、大鼠等動(dòng)物均可用于制作乳腺炎病理模型[5 - 6]。小鼠價(jià)格低廉，成本低，重復(fù)性好，國內(nèi)外乳腺炎模型多采用小鼠建立乳腺炎模型[7]。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌常用作乳腺炎模型的誘導(dǎo)細(xì)菌，但菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏一致性和重復(fù)性[8]。脂多糖是大腸埃希菌細(xì)胞壁外膜主要成分，可通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)乳腺炎，具有良好的一致性和重復(fù)性[4]。本研究采用小鼠作為乳腺炎病理模型研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用脂多糖誘導(dǎo)乳腺炎動(dòng)物模型，解穎穎等[4]研究顯示，10、20、40、50 μg脂多糖注射后24 h均可誘導(dǎo)不同程度乳腺炎病理模型，本研究參考其結(jié)果，取50 μg脂多糖注射后24 h進(jìn)行觀察。

細(xì)胞因子在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，脂多糖可誘導(dǎo)乳腺局部炎癥組織浸潤，導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放增加，炎癥因子釋放增加一方面可趨化免疫細(xì)胞清除病原體，但炎癥反應(yīng)進(jìn)展可引起乳腺微循環(huán)障礙，導(dǎo)致乳腺組織壞死、化膿，控制乳腺炎患者炎癥反應(yīng)對(duì)治療具有重要作用[9]。此外，研究表明，脂多糖作用下TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子含量增加，導(dǎo)致單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞集聚，誘導(dǎo)并促進(jìn)前列腺素、溶酶體酶和過氧化氫類物質(zhì)等的釋放，引起或加重炎癥[10]，所以TNF-α、IL-6、IL-1β不僅可作為診斷炎性反應(yīng)的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，也可作為反映治療效果與炎性狀態(tài)的重要參考指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，脂多糖誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型乳腺組織中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA水平和蛋白水平顯著增加。

因?yàn)榭股氐亩靖弊饔煤湍退幮?，治療乳腺炎臨床應(yīng)用受到一定限制，傳統(tǒng)中藥具有多靶點(diǎn)作用，在炎癥治療中發(fā)揮積極作用。中醫(yī)無急性乳腺炎之病名，多根據(jù)臨床癥狀將其歸于“乳癰”范疇，病機(jī)主要為乳汁於積，乳絡(luò)阻塞成塊，郁久化熱釀膿而成癰腫，早期紅腫熱痛表現(xiàn)明顯，熱毒與炎癥在病理、病機(jī)、治則方面具有密切聯(lián)系，治療以清熱解毒、散結(jié)消腫為主[11]。梔子是臨床常用清熱解毒中藥，梔子苷是梔子的有效成分，體外培養(yǎng)脂多糖誘導(dǎo)損傷的大鼠巨噬細(xì)胞，應(yīng)用梔子苷治療可降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子釋放[12]。Yang等[13]采用脂多糖誘導(dǎo)制造肺炎小鼠模型，采用梔子苷進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，梔子苷治療可顯著降低IL-4、IL-5、IL-13和細(xì)胞黏附分子表達(dá)。Shi等[14]研究則顯示，梔子苷的抗炎機(jī)制可能與其抑制NF-κB、TLR4、MMP9表達(dá)和減少前炎癥細(xì)胞因子有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，L組、M組和H組小鼠炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，間質(zhì)水腫緩解，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平和蛋白水平顯著低于模型組，且隨著劑量增加，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平和蛋白水平逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，結(jié)果提示，梔子苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的乳腺炎癥損傷，有降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子水平的作用。

本研究的不足之處在于：①初步闡明了梔子苷可抑制乳腺炎動(dòng)物模型乳腺組織炎癥因子表達(dá)，梔子苷通過何種機(jī)制發(fā)揮抑制炎癥因子表達(dá)的作用尚需要進(jìn)一步研究探討；②本研究設(shè)計(jì)前，經(jīng)查詢相關(guān)文獻(xiàn)，未查找到良好的在臨床或?qū)嶒?yàn)室具有同樣或類似藥理作用機(jī)制的陽性藥物，本研究實(shí)驗(yàn)中未設(shè)置陽性對(duì)照組，在下一步闡明梔子苷抑制炎癥因子作用機(jī)制的研究中，將設(shè)置陽性對(duì)照組進(jìn)一步研究探討。