張玲玉，劉穎蕾，喬海風，開海麗，劉曼華*，吳劉成

(1.南通大學第二附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001； 2.南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226001； 3.南通大學實驗動物中心，江蘇 南通 226001)

子宮內膜異位癥(endometriosis)是一種婦科常見疾病，在育齡期婦女中的發(fā)病率在2%～10%，在不孕婦女中發(fā)病率高達50%[1]。臨床主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛及不孕，嚴重影響了婦女的健康和生活質量。子宮內膜異位癥在治療后5年復發(fā)率為45%～50%[2]。這個數(shù)據(jù)在被手術確診的年齡小于21歲的婦女中甚至可達到56%[3]。子宮內膜異位癥需要長期、個體化治療。作為一種雌激素相關性疾病，抑制內源性雌激素是延緩內異癥復發(fā)的關鍵。促性腺激素釋放激素受體激動劑(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a)有藥物去勢的作用，可以迅速將血清雌二醇降低至絕經(jīng)期水平,但隨之而來的潮熱、盜汗、情緒波動等低雌激素癥狀限制了GnRH-a的長期用藥。為緩解低雌激素癥狀，近年來提出來反添加療法，但目前反添加療法開始時間和如何用藥臨床上尚無統(tǒng)一標準[4]。本研究通過自體移植建立大鼠子宮內膜異位癥模型，建模成功后，給予亮丙瑞林反加不同劑量的雌激素治療，比較治療前后大鼠子宮內膜異位灶體積大小、子宮內膜異位灶組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)以及血清糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)的表達水平，評估子宮內膜異位癥的治療效果以及治療后復發(fā)情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，每只體重180～200 g，2月齡，雌性，購自南通大學實驗動物中心[SCXK (蘇) 2014-0001]，動物從業(yè)人員上崗證號：220180114，飼養(yǎng)環(huán)境：南通大學實驗動物中心[SYXK (蘇) 2017-0046]，溫度：22℃～24℃，濕度：45%～70%，12 h明暗交替，自然飼養(yǎng)。一切進入屏障系統(tǒng)的人、物、飼料、水、空氣、鋪墊物及各種用品均須經(jīng)過嚴格的微生物控制。在常規(guī)條件下適應性飼養(yǎng)1周。實驗方案經(jīng)過南通大學實驗動物中心動物倫理委員會批準，編號為：20161202-001。無菌手術在南通大學實驗動物中心實驗室進行[SYXK (蘇) 2017-0046]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

多克隆抗體TNF-α及StAR一抗(Abcam)，DAB染色試劑盒(V9000，中杉金橋)，CA125 ELISA試劑盒(ml6024076)；注射用醋酸亮丙瑞林微球(天津武田藥品有限公司)。光學顯微鏡，石蠟切片機，游標卡尺，微波爐，移液器，冷凍離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模

60只SD大鼠術前1 d皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg)，使所有實驗動物處于同一動情周期。手術當天禁食禁飲。SD大鼠予水合氯醛(7%)麻醉后，取大鼠下腹正中、尿道口上端1 cm做一長約2～3 cm縱行切口，結扎子宮系膜血管，再結扎需切除的子宮段的兩端，其左側子宮角切下約1.5 cm長片段，置于37℃無菌PBS緩沖液中，分離子宮內膜，取其0.5 cm × 0.5 cm一段，于腹壁切口兩側從腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，將分離的子宮內膜展平置于隧道內，內膜緊貼肌層，縫合切口，整個手術控制在15 min左右[5]，將手術完畢的大鼠置于干凈的飼養(yǎng)籠中，保溫至蘇醒。術后予慶大霉素0.1 mL/d肌注3 d預防感染。

1.3.2 分組與給藥

建模4周后開腹探查，51只大鼠建模成功。休息3 d，將建模成功的51只大鼠按隨機數(shù)字表法分為五組：對照組：予生理鹽水1 mg/kg皮下注射，共1次；研究組：反加組Ⅰ(10只)、反加組Ⅱ(10只)、反加組Ⅲ(10只)、GnRH-a組(11只)。研究組先予亮丙瑞林1 mg/kg皮下注射[6]，共1次，其中反加組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別在給藥第2周開始予不同劑量的戊酸雌二醇灌胃反加[7]，反加組Ⅰ(低劑量雌激素組)：25 μg/(kg·d)，反加組Ⅱ(中劑量雌激素組)：50 μg/(kg·d)，反加組Ⅲ(高劑量雌激素組)：100 μg/(kg·d)，每天1次，共14 d，GnRH-a組在給藥第2周予生理鹽水灌胃反加，3 mL/(只·d)，每天1次，共14 d。在治療過程中對照組有1只大鼠因切口感染死亡；反加組Ⅰ有1只大鼠因切口感染死亡,2只大鼠因灌胃食道損傷死亡；反加組Ⅱ組有2只大鼠因切口感染死亡；反加組Ⅲ有2只大鼠因灌胃食道損傷死亡；GnRH-a組有2只大鼠因切口感染死亡,1只大鼠因灌胃食道損傷死亡。

1.3.3 取材

分別在亮丙瑞林給藥后第4周及第7周，開腹探查，測量內異灶大小，取內異灶組織，置于4%多聚甲醛溶液中保存，石蠟包埋，用于免疫組化檢測；用眼眶內眥靜脈叢的采血法采血，4℃1000 r/min離心20 min，收集上清，-80℃保存，用于ELISA檢測。

1.3.4 免疫組化

組織經(jīng)中性福爾馬林固定后，取材，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，采用LSAB法，染色步驟按照說明書進行，用DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色后，復染、脫水、透明、封片。以PBS(磷酸鹽緩沖液)代替一抗作陰性對照。每批實驗均同時設立陰性對照。

1.3.5 ELISA法

用于測定血清中CA125的含量，嚴格按試劑盒說明的實驗步驟檢測。

1.3.6 結果判定

顯微鏡下觀察，每張免疫組化切片隨機選擇3個不同的視野(×400)觀察，并判讀陽性表達強度和陽性率。染色結果采用半定量分析方法：以染色強度結合陽性細胞數(shù)百分比進行評分。染色強度計分：無明顯著色為0分，淡黃色或輕微黃色為1分，深黃或棕黃色為2分，棕褐色或黑褐色為3分。陽性細胞百分比即每張免疫組化切片選擇3個不同的視野(×400)觀察，每個視野計數(shù)100個細胞中陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞平均數(shù)：≤5%為評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，>75%均評為4分。對每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比乘積評分，評分以陽性細胞百分比與染色強度的乘積：0分為陰性，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠內異癥模型建立

建模28 d后開腹探查，60只大鼠中51只建模成功。建模成功的大鼠腹壁，肉眼可見異位病灶呈囊泡樣，內充滿透亮液體，表面被覆豐富脂肪組織，移植物表明可見新生血管爬行生長，周圍結締組織豐富。HE染色鏡下觀察異位囊壁由內向外分別為上皮細胞層、間質細胞層及少量纖維結締組織。上皮細胞呈柱狀排列,大部分上皮細胞有分泌現(xiàn)象可見核下空泡,間質層薄,少數(shù)可見腺體分布。見圖1。

注：a：治療前大鼠內異灶肉眼觀察；b：異位內膜(HE染色，× 10)；c：在位內膜(HE染色，× 10)。圖1 大鼠子宮內膜異位灶及組織學觀察Note. a: Endometriosis in a rat model (gross appearance). b: Histology of the ectopic endometrium in a rat (HE staining, × 10). c: Eutopic endometrium in a rat (HE staining, × 10).Figure 1 Endometriosis in a rat model and histological observation

2.2 大鼠內異癥模型用藥前后各組內異灶體積

用藥前，各組內異癥的體積間差異無顯著性(P> 0.05)。第4周，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠腹壁異位病灶體積較用藥前明顯縮小，對照組的體積較用藥前增大，差異均有顯著性(P< 0.05)。第7周，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠腹壁異位病灶體積較第4周均有增大，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、GnRH-a組較用藥前明顯減小，差異均有顯著性(P< 0.05)，反加組Ⅲ較用藥前相比差異無顯著性，對照組與第4周相比，差異無顯著性(P> 0.05)；第7周時，反加應用中、高劑量雌激素組(反加組Ⅱ、反加組Ⅲ)較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組(反加組Ⅰ、GnRH-a組)體積增大明顯，差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

2.3 免疫組化表達

2.3.1 TNF-α在大鼠內異癥病灶組織中的表達

TNF-α蛋白主要表達在子宮內膜異位癥異位內膜組織腺上皮細胞的細胞漿中，間質細胞漿中少量表達。陽性呈棕黃色至褐色(圖2)。用藥前，各組內異癥病灶組織中TNF-α表達差異無顯著性(P> 0.05)。第4周，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠腹壁異位病灶TNF-α表達均較用藥前縮小，且均較對照組明顯縮小，差異均有顯著性(P< 0.05)，而對照組的TNF-α表達與用藥前相比差異無顯著性(P> 0.05)。第7周，反加組Ⅱ、反加組Ⅲ大鼠腹壁異位病灶TNF-α表達較第4周增加，差異有顯著性(P< 0.05)；對照組、反加組Ⅰ、GnRH-a組表達與第4周相比差異無顯著性(P> 0.05)；反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、GnRH-a組TNF-α表達較用藥前明顯減小，差異均有顯著性(P< 0.05)，反加組Ⅲ較用藥前相比差異無顯著性；第7周時反加應用中、高劑量雌激素組(反加組Ⅱ、反加組Ⅲ)較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組(反加組Ⅰ、GnRH-a組)TNF-α表達高，差異有顯著性(P< 0.05)。見表2。

注：a：免疫組化(× 10)；b：免疫組化(× 40)。圖2 TNF-α在大鼠內異癥組織的表達Note. a: Immunohistochemical staining (× 10). b: Immuno-histochemical staining (× 40).Figure 2 TNF-α expression in the ectopic endometrium

表1 GnRH-a用藥后反加不同劑量雌激素大鼠異癥病灶體積變化±s，mm3)

注：反加組Ⅰ：低劑量雌激素組：25 μg/(kg·d)；反加組Ⅱ：中劑量雌激素組：50 μg/(kg·d)；反加組Ⅲ：高劑量雌激素組：100 μg/(kg·d)。與同組用藥前比較，aP< 0.05；與同組第4周比較，bP< 0.05；與對照組比較，cP< 0.05。

Note. Add-back group Ⅰ: low-dose estrogen group: 25 μg/(kg·d); Add-back group Ⅱ: medium-dose estrogen group: 50 μg/(kg·d); Add-back group Ⅲ: high-dose estrogen group: 100 μg/(kg·d). Compared with the same group before treatment,aP< 0.05; compared with the same group at the 4th week,bP< 0.05; compared with the control group,cP< 0.05.

表2 GnRH-a用藥后反加不同劑量雌激素大鼠子宮內膜異位病灶組織中TNF-α和StAR的表達±s)

注：反加組Ⅰ：低劑量雌激素組：25 μg/(kg·d)；反加組Ⅱ：中劑量雌激素組：50 μg/(kg·d)；反加組Ⅲ：高劑量雌激素組：100 μg/(kg·d)。與同組治療前比較，aP< 0.05；與同組治療4周比較，bP< 0.05；與對照組同一時間點比較，cP< 0.05；與GnRH-a組同一時間點比較，dP< 0.05。

Note. Add-back group Ⅰ: low-dose estrogen group: 25 μg/(kg·d); Add-back group Ⅱ: medium-dose estrogen group: 50 μg/(kg·d); Add-back group Ⅲ: high-dose estrogen group: 100 μg/(kg·d). Compared with the same group before treatment,aP< 0.05; compared with the same group at the 4th week,bP< 0.05; compared with the control group at the same time,cP< 0.05; compared with the GnRH-a group at the same time,dP< 0.05.

2.3.2 StAR在大鼠內異癥病灶組織中的表達

StAR主要表達于異位內膜組織腺上皮細胞的細胞漿中，在位內膜中很少表達。陽性呈棕黃色至褐色(圖3)。用藥前，各組內異癥病灶組織中StAR表達差異無顯著性(P> 0.05)。第4周，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠腹壁異位病灶StAR均較用藥前減小，差異有顯著性(P< 0.05)，且均較對照組明顯降低，差異有顯著性(P< 0.05)，而對照組的大鼠腹壁異位病灶StAR表達與用藥前相比差異無顯著性(P> 0.05)。第7周，對照組大鼠腹壁異位病灶StAR表達較用藥前減小，差異有顯著性(P< 0.05)；反加組Ⅱ、反加組ⅢStAR表達較第4周增加，差異有顯著性(P< 0.05)；反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、GnRH-a組StAR表達較用藥前明顯減小，差異均有顯著性(P< 0.05)；反加組Ⅲ較用藥前相比差異無顯著性；第7周時反加應用中、高劑量雌激素組(反加組Ⅱ、反加組Ⅲ)較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-α組(反加組Ⅰ、GnRH-a組)StAR表達高，差異有顯著性(P< 0.05)。見表2。

注：a：免疫組化(× 10)；b：免疫組化(× 40)。圖3 StAR在大鼠內異癥組織的表達Note. a: Immunohistochemical staining (× 10). b: Immuno-histochemical staining (× 40).Figure 3 StAR expression in the ectopic endometrium

2.4 血清CA125在大鼠內異癥模型中的表達

用藥前，各組血清CA125濃度差異無顯著性(P> 0.05)，第4周，反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠血清CA125濃度平均數(shù)均減小，與用藥前相比差異有顯著性(P< 0.05)，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.05)，而對照組的評分與用藥前相比差異無顯著性(P> 0.05)。第7周，反加組Ⅱ、反加組Ⅲ大鼠血清CA125濃度較第4周增加，差異有顯著性(P< 0.05)；GnRH-a組大鼠血清CA125濃度較4周同組減小，差異有顯著性(P< 0.05)；對照組、反加組Ⅰ與第4周相比差異無顯著性(P> 0.05)；反加組Ⅰ、反加組Ⅱ、反加組Ⅲ、GnRH-a組大鼠血清CA125濃度較用藥前明顯減小，差異均有顯著性(P< 0.05)；第7周時反加應用中、高劑量雌激素組(反加組Ⅱ、反加組Ⅲ)較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組(反加組Ⅰ、GnRH-a組)血清CA125濃度高，差異有顯著性(P< 0.05)。見表3。

表3 GnRH-a用藥后反加不同劑量雌激素大鼠血清CA125濃度的變化±s，U/mL)

注：反加組Ⅰ：低劑量雌激素組：25 μg/(kg·d)；反加組Ⅱ：中劑量雌激素組：50 μg/(kg·d)；反加組Ⅲ：高劑量雌激素組：100 μg/(kg·d)。與同組治療前比較，aP< 0.05；與同組治療4周比較，bP< 0.05；與對照組同一時間點比較，cP< 0.05；與GnRH-a組同一時間點比較，dP< 0.05。

Note. Add-back group Ⅰ: low-dose estrogen group: 25 μg/(kg·d); Add-back group Ⅱ: medium-dose estrogen group: 50 μg/(kg·d); Add-back group Ⅲ: high-dose estrogen group: 100 μg/(kg·d). Compared with the same group before treatment,aP< 0.05; compared with the same group at the 4th week,bP< 0.05; compared with the control group at the same time,cP< 0.05; compared with the GnRH-a group at the same time,dP< 0.05.

3 討論

子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，治療后易復發(fā)，其機制尚不清楚。臨床上評估子宮內膜異位癥復發(fā)的依據(jù)為：(1)癥狀：以盆腔疼痛為主訴，達到甚至超過術前水平；(2)盆腔檢查：再次出現(xiàn)包塊，直腸陷窩觸痛結節(jié)等；(3)B超示卵巢囊腫，囊腫為中低回聲，甚至出現(xiàn)點狀強回聲；(4)血清CA125降低后再次升高。但確診，仍需使用腹腔鏡檢查通過組織學證實?？紤]到反復使用腹腔鏡的倫理及實際應用問題，本實驗采用大鼠子宮內膜異位癥模型進行研究。

GnRH-a現(xiàn)已廣泛應用于治療子宮內膜異位癥，本研究應用亮丙瑞林治療大鼠子宮內膜異位癥模型發(fā)現(xiàn)，第4周，研究組較對照組體積明顯縮小，血清CA125水平下降，而對照組內異癥模型體積增大，提示亮丙瑞林對大鼠子宮內膜異位癥模型療效肯定。GnRH-a治療過程中機體血清雌二醇迅速降低至絕經(jīng)期水平，若機體長期處于低雌激素血癥狀態(tài)，可出現(xiàn)潮熱、盜汗、陰道干燥、頭痛等血管舒縮癥狀及不可逆的骨丟失等不良反應[8,14]。長期低雌激素血癥，會引起原始卵泡減少，卵泡閉鎖，導致卵巢功能受損[9]。為緩解低雌激素血癥癥狀，保護卵巢功能，近年來提出來“反添加”療法，即GnRH-a與類固醇激素聯(lián)合應用。如何調節(jié)GnRH-a和類固醇激素的用量和應用時間的長短仍是值得我們研究的問題，脈沖式加用性激素是否會激惹隱伏的雌激素敏感組織，從而導致疾病提前復發(fā)的問題值得我們進一步探討。

本研究采用不同劑量雌激素進行反添加，在第7周時，研究組大鼠腹壁異位病灶體積較第4周均有不同程度增大，提示停藥后可能出現(xiàn)了子宮內膜異位癥的復發(fā)傾向，反加應用中、高劑量雌激素組較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組體積增大明顯，且反加應用中、高劑量雌激素組血清CA125較治療第4周升高，提示反加應用中、高劑量雌激素可能加速了內異癥的復發(fā)。進一步說明內異癥是一種雌激素依賴性疾病，對內異癥的反加治療應注意雌激素的應用劑量，與Barbieri[10]的研究結論一致。

TNF-α是一類具有多種生物活性的細胞因子，由激活的單核細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等產(chǎn)生，在生理狀態(tài)下，TNF-α參與調節(jié)胚胎著床、卵泡發(fā)育、免疫監(jiān)視、抗腫瘤等環(huán)節(jié)[11]；在病理狀態(tài)下，TNF-α可介導炎癥反應和免疫反應。TNF-α在子宮內膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中炎癥浸潤、新生血管形成、粘連的形成等環(huán)節(jié)發(fā)揮了巨大作用。TNF-α不僅可以誘導IL-6、IL-8等炎癥因子釋放，誘導新生血管生成，還可以促進間質細胞和間皮之間的粘附，刺激子宮內膜間質細胞的生成[12]，可能在子宮內膜異位癥的形成和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，用藥前，TNF-α在子宮內膜異位組織中高表達，提示高水平的TNF-α可能促進了內異癥的發(fā)生、發(fā)展的過程；第4周，研究組子宮內膜異位灶組織中TNF-α表達降低，提示GnRH-a對子宮內膜異位癥大鼠模型有較好的治療作用；在停藥觀察3周后，反加中、高劑量雌激素組較反加低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組大鼠子宮內膜異位癥組織TNF-α表達高，提示中、高劑量雌激素可能通過提高TNF-α表達促進子宮內膜異位癥的復發(fā)，其可能機制為中、高劑量雌激素刺激單核細胞、淋巴細胞和巨噬細胞再次分泌TNF-α，增高的TNF-α促進異位內膜炎癥細胞因子IL-6、IL-8等的釋放，進而誘發(fā)異位內膜及基質細胞增殖、血管再生、刺激成纖維細胞增殖及膠原合成，從而再次形成異位病灶。

Attar[13]等發(fā)現(xiàn)子宮內膜異位細胞含有類固醇生成的完整基因，能將膽固醇從頭合成雌二醇。StAR是類固醇激素合成的重要限速酶，可將膽固醇從線粒體的外膜轉運至內膜，在其它類固醇激素合成酶如P450scc、芳香化酶等的作用下，合成雌二醇[15]。子宮內膜異位組織可以通過StAR從頭合成雌激素，造成局部高雌激素狀態(tài)，加速子宮內膜異位癥進展。激活的巨噬細胞能夠產(chǎn)生各種類型的細胞因子和PGs，PGE2能誘導StAR表達[16]，促進局部雌激素的合成，為子宮內膜異位癥的形成與發(fā)展打下基礎。本研究發(fā)現(xiàn)，用藥前，StAR在大鼠子宮內膜異位病灶組織中表達增高，提示StAR可能參與了大鼠內異癥的發(fā)生發(fā)展，用藥第4周，研究組StAR表達降低，再次說明GnRH-a對子宮內膜異位癥大鼠模型有較好的治療作用，在停藥觀察3周后，反加中、高劑量雌激素組較低劑量雌激素組和單純應用GnRH-a組大鼠子宮內膜異位癥組織StAR表達高，提示中、高劑量雌激素可能通過誘導StAR的高表達促進子宮內膜異位癥的復發(fā)，其機制可能為中、高劑量的雌激素作用下，異位內膜組織中巨噬細胞的數(shù)量增加，激活的巨噬細胞分泌PGE2，上調了StAR的表達，外周組織中膽固醇芳香構化，局部合成雌激素，雌激素與雌激素受體結合，啟動雌激素介導的信號通路，誘導相關細胞因子參與并促進子宮內膜異位病灶的再次形成。

綜上所述，GnRH-a反加低劑量雌激素治療大鼠內異癥模型可有效縮小病灶，降低TNF-α、StAR及CA125的表達，療效確切。但反向添加中、高劑量雌激素可能加速了大鼠子宮內膜異位癥的復發(fā)，TNF-α、StAR表達的再次升高可能是子宮內膜異位癥復發(fā)的機制。但本實驗樣本量較小，隨訪時間較短，尚需大樣本、長時期隨訪進一步研究證實。另本實驗為動物實驗，在對人的臨床應用中尚存在一定差距，還需循證醫(yī)學證據(jù)。