徐蓉,豐宇芳,陳正紅2#蘇州大學附屬張家港醫(yī)院病理科,江蘇 張家港 25600

2江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院婦產科,南京2100280

微小RNA(micro RNA,miRNA)由一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈分子組成,其特點是轉錄后可以水平調控靶基因的表達[1],對細胞的生長、遷移及凋亡均有非常重要的意義[1-2].相關研究表明,miRNA參與體內多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,并且可以廣泛調控腫瘤基因的表達,因此推測miRNA可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[3].結直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是全球發(fā)病率極高的一種腫瘤,病死率極高[4-5].結腸癌多表現(xiàn)為多基因及表觀遺傳改變[5].大量研究表明,在結腸癌的發(fā)生過程中,某些特定的miRNA起著重要調控作用,因此這些特定的miRNA可以成為結腸癌診斷和生物治療的新靶標[6-9].還有研究顯示,miRNA-95這類微小RNA能夠通過調節(jié)癌基因,從而對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到一定的作用[8,10-11].還有部分相關類型研究報道顯示,miRNA-95能夠通過抑制SNX1的表達,促進結腸癌細胞的增殖[8].但是關于miRNA-95-3p能否通過對其他基因進行調控,從而對結腸癌產生一定影響的研究尚少,因此,本研究對miRNA-95-3p在結腸癌患者中的表達情況及其對結腸癌細胞SW620增殖、遷移能力的影響進行探討,現(xiàn)報道如下.

1 材料與方法

1.1 病理組織收集

收集2017年1-10月蘇州大學附屬張家港醫(yī)院采集并保存的結腸癌患者的結腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織.納入標準:①病理組織保存完好、完整,可用于后期實驗操作;②與組織相匹配的患者信息全面,具有明確的結腸癌診斷信息;③除腫瘤組織外,還有對應的癌旁正常腸黏膜組織.排除標準:①病理組織有反復凍融情況,保存缺失不完整、不完好;②組織對應的患者病歷資料不完整,無明確診斷信息;③無對應的癌旁正常腸黏膜組織.根據(jù)納入和排除標準,本研究共選取10例結腸癌患者的結腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織.

1.2 細胞株及質粒

結腸癌SW620細胞株購自博士德生物工程公司(武漢);雙熒光素酶報告質粒系統(tǒng)(pmirGLO Vector)委托吉瑪公司(中國上海)構建與合成,該質粒體系概述如下:首先進行p21的3'-UTR區(qū)域全基因片段合成,在片段區(qū)域兩端設計酶切位點,插入熒光蟲熒光素酶(firefly luciferase)3'-UTR的克隆位點;該質粒也包含海腎熒光素酶(renilla luciferase)基因.

1.3 主要試劑

胎牛血清及胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司,總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自美國Roch公司,實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)特異性定量引物和內參U6均由廣州市銳博生物科技有限公司合成.OMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司.

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將SW620細胞接種于含10%胎牛血清+1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);SW620細胞復蘇后,以(2～5)X105/ml密度種植于培養(yǎng)瓶內,12 h后觀察細胞的生長狀態(tài),采用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代(約2天1次),取對數(shù)生長期的SW620細胞用于后續(xù)實驗.

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-95-3 p表達 按照總RNA提取試劑操作說明提取結腸癌患者結腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織中的總RNA,采用紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度.以上述提取的總RNA中的mRNA作為模板,按照mRNA逆轉錄說明書將所提取的mRNA逆轉錄為cDNA,保存于-20℃?zhèn)溆?將逆轉錄得到的cDNA用實時熒光定量PCR引物制備稀釋后采用實時熒光定量試劑盒于實時定量PCR儀上進行擴增,檢測miRNA-95-3p的表達情況,每個樣本設計3個平行孔,共進行3次重復實驗.每次檢測均以U6為內參照,通過熒光定量法2-△△Ct計算miRNA-95-3p的相對表達量.

1.4.3 細胞轉染 取對數(shù)生長期的SW620細胞,對SW620細胞進行分組:過表達組,轉染miRNA-95-3p mimics;對照組,不進行轉染.調整兩組細胞濃度為(1.0～1.5)X106/ml,接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng),待細胞匯合度達到60%～70%時進行轉染.將完全培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清和雙抗的基礎培養(yǎng)基,每孔培養(yǎng)基1 ml,隨后用100 μl OMEM稀釋miRNA-95-3p mimics及LipofectamineTM2000,依照說明書推薦比例混勻后靜置20 min,然后將混合溶液逐滴加入對應孔并輕晃混勻;溫箱放置6 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集兩組細胞進行下一步分析.

1.4.4 CCK-8法檢測SW620細胞的增殖情況 取過表達組和對照組SW620細胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2組細胞,調整細胞濃度為1X105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)基200 μl,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8試劑200 μl,再持續(xù)培養(yǎng)2 h.采用酶標儀檢測各孔在450 nm處光密度值(optical density,OD),以對應的OD值表示細胞增殖能力.

1.4.5 劃痕實驗 取過表達組和對照組SW620細胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2組細胞,調整細胞濃度為1X105/ml,接種于6孔板中,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),待細胞增長至匯合度80%以上時,用10 μl微量移液頭消毒后在6孔細胞板上垂直劃痕,采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細胞3次,24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況.

1.4.6 Western blot檢測各組細胞 p21蛋白的表達 收集培養(yǎng)48 h的過表達組和對照組SW620細胞,提取細胞總蛋白,采用BCA法測量細胞總蛋白濃度,然后在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠小孔內添加50 μg經過變性處理后的蛋白質,再進行濃縮膠層80 V恒壓至樣品在分離膠層壓成一條線時,電壓調至120 V,繼續(xù)電泳,電泳后于冰水混合物中300 mA轉膜2 h,麗春紅染色10 min觀察轉移效果,隨后在5%脫脂奶粉的搖床上孵育2 h;加入一抗(1∶500兔抗人p21多抗,1∶5000兔抗人GAPDH單抗)置于4℃孵育過夜;洗膜后加入羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,采用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影得到蛋白印跡條帶,采用Tanon軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內參,相對定量結果以灰度值/光密度值表示.

1.4.7 雙熒光素酶實驗 取對數(shù)生長期的SW620細胞,調整細胞濃度為1X105/ml,接種于48孔板中,常規(guī)培養(yǎng),待細胞匯合度至70%后,用于后續(xù)轉染操作.將接種于48孔板的SW620細胞分為4組:A組,共轉染pMIR-NC質粒和miRNA-95-3p;B組,共轉染pMIR-p21質粒和miRNA-control組;C組,共轉染pMIR-NC質粒和miRNA-control組;D組,共轉染pMIR-p21質粒和miRNA-95-3p組;轉染方法同"1.4.3",轉染48 h后進行雙熒光素酶報告實驗.去除每孔內完全培養(yǎng)基,加入適量的報告基因細胞裂解液,而后每孔加入100 μl螢火蟲熒光素酶檢測緩沖液;采用多功能酶標儀檢測孔內相對光單位(relative light unit,RLU),而后每孔加入海腎熒光素酶檢測工作液后再次測定RLU.每孔熒光素酶活性相對值=螢火蟲熒光素酶RLU/海腎熒光素酶RLU.

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟-件對數(shù)據(jù)進行分析.計量資料以均數(shù)±標準差()表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多組組間兩兩比較比較采用SNK法.以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 miRNA-95-3 p相對表達量的比較

實時熒光定量PCR分析結果顯示:結腸癌組織中miRNA-95-3p的相對表達量為(2.57±0.26),明顯高于癌旁正常腸黏膜組織的(1.00±0.24),差異有統(tǒng)計學意義(t=7.69,P<0.01).

2.2 SW620細胞增殖能力的比較

CCK-8法檢測結果顯示,過表達組SW620細胞的增殖能力為(1.38±0.24),明顯高于對照組的(0.68±0.16),差異有統(tǒng)計學意義(t=4.20,P<0.01).

2.3 SW620細胞體外遷移能力的比較

過表達組SW620細胞的劃痕區(qū)域相對寬度為(81.1±3.7)%,明顯高于對照組的(47.6±7.3)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.09,P<0.01).

2.4 轉染后SW620細胞中 p21蛋白的相對表達量

Western blot檢測結果顯示:對照組SW620細胞中p21蛋白的相對表達量為(1.00±0.11),過表達組SW620細胞中p21蛋白的相對表達量為(0.64±0.19),過表達組SW620細胞中p21蛋白的相對表達量低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=2.84,P<0.05).

2.5 轉染后SW620細胞熒光素酶活性的比較

雙熒光素酶實驗結果顯示:4組SW620細胞的熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=183.16,P<0.01).其中,B組、D組SW620細胞的熒光素酶活性均較C組和A組降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),A組SW620細胞的熒光素酶活性與C組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);B組SW620細胞的熒光素酶活性與D組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).(表1)

表1 轉染后SW620細胞熒光素酶活性的比較(±s)

表1 轉染后SW620細胞熒光素酶活性的比較(±s)

注:a與D組比較,P<0.05;b與C組比較,P<0.05;c與B組比較,P<0.05

指標熒光素酶活性5.43±0.09a c 3.71±0.18a b 5.82±0.15a c 2.84±0.26b A組B組C組D組

3 討論

結腸癌是一種比較常見的惡性腫瘤,病死率較高[5].多數(shù)結腸癌患者被確診時已處于中晚期,盡管目前針對結腸癌的治療方法不斷革新,包括了傳統(tǒng)手術治療以及放化療在內的保守治療等,但是各種治療方法對于晚期結腸癌患者的治療效果均不是很理想.由于結腸癌早期診斷方法的不完善,導致患者的最佳治療時期被延誤,多數(shù)結腸癌患者的術后5年生存率仍較低[12].因此,對結腸癌早期診斷方法的改革已經成為臨床急需解決的關鍵難點.結腸癌的發(fā)生是一個多基因共同參與、多步驟完成的復雜生物學形成過程,這也提示需要從多種分子水平對其發(fā)生機制進行研究.通過對結腸癌發(fā)生機制的探索,有利于全面了解結腸癌的發(fā)生過程,進而有利于尋找新的治療靶標[13].

目前,生命科學的研究已進入后基因組時代,人們對基因的研究首先轉變成先了解基因序列,再通過逆基因手段抑制目標基因表達,最后才觀察表型的變化,而miRNA則是目前的研究熱點[14].相關研究顯示,人體內超過30%～35%的蛋白質編碼基因都受到了miRNA的調控,miRNA基本上影響了所有的分子信號轉導通路[1].大多數(shù)的癌基因和抑癌基因均是miRNA的靶基因,因而在腫瘤中miRNA的靶基因可以作為抑癌基因下調原癌基因的活性,或者作為癌基因下調抑癌基因的活性[15-16].近年來,miRNA在結腸癌中的研究備受關注,因其特別的轉錄后調控方式,從而為結腸癌的研究提供了一類嶄新的思路和方式.由于miRNA在結腸癌中的異常表達逐漸被發(fā)現(xiàn),其部分的作用靶點和機制得以初步闡明[6-8,17].但是,miRNA在結腸癌中起到許多關鍵性的作用依舊未見報道.

已有研究表明,miRNA-95參與了肺癌、神經角質素瘤、肝癌等多種類型腫瘤的發(fā)生過程,其通過調控下游多種靶基因對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進行調節(jié)[8,10-11,18-20].近年來有相關報道指出,miRNA-95能進一步促進結腸癌的發(fā)生[8].在結腸癌的發(fā)展過程中,細胞周期遭到破壞是導致結腸癌細胞增殖的重要原因之一.細胞周期蛋白可以調控細胞周期,通過對細胞周期進行抑制,可以抑制各類腫瘤的發(fā)生.p21是由CDKN1A基因編碼的一種蛋白質,已有研究表明,p21蛋白是細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)的抑制藥[21-22],通過p21蛋白對CDK2和CDK4的活性進行抑制,從而抑制細胞周期進入S期[22].相關研究表明,miRNA-95-3p能抑制hepG2細胞中p21蛋白的表達,從而抑制肝癌細胞的增殖[19].

本研究對miRNA-95-3p與結腸癌的關系進行研究,結果發(fā)現(xiàn)結腸癌患者結腸癌組織中miRNA-95-3p的表達水平較癌旁正常腸黏膜組織明顯升高.表明在結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中,miRNA-95-3p起到了實質性關鍵作用.為了更好地尋找結腸癌的診斷突破點,為結腸癌的治療提供新的思路和靶點,本研究還對miRNA-95-3p的表達情況進行了進一步分析.為了能更深層次的研究miRNA-95-3p對結腸癌的影響,本研究對結腸癌SW620細胞進行轉染,結果發(fā)現(xiàn),轉染miRNA-95-3p后能夠明顯提升SW620細胞的增殖及遷移能力.表明過表達miRNA-95-3p可以促進腫瘤細胞的增殖和遷移.為了研究miRNA-95-3p促進SW620細胞增殖及遷移的分子機制,本研究對SW620細胞進行轉染,并檢測p21蛋白的表達量.結果證實,轉染miRNA-95-3p能夠抑制SW620細胞中p21蛋白的表達.雖然該實驗能確定p21與miRNA-95-3p的調控相關性,但是卻不能鑒定miRNA-95-3p的靶位點.為了更進一步確定miRNA-95-3p在結腸癌中是否與p21的3'-UTR直接作用,本研究進行了雙熒光素酶實驗.目前,雙熒光素酶實驗是miRNA靶位點鑒定的常見的一種方法,該報告系統(tǒng)由兩部分構成,分別是熒光素酶表達載體和包含目的miRNA靶基因3'-UTR克隆的熒火蟲熒光素酶基因標記報告質粒;通過將表達載體和報告質粒同時轉入細胞中表達,當細胞表達報告基因時熒光素酶激活表達載體,通過吸收光檢測從而實現(xiàn)對目的miRNA靶位點的鑒定.如相對應基因的3'-UTR中含有miRNA的結合位點,則細胞內上調的miRNA將結合于靶基因3'-UTR,得以阻礙了螢火蟲熒光素酶的翻譯.當過表達miRNA-95-3p和含有p21的3'-UTR的雙熒光素酶載體共轉染SW620細胞時,螢火蟲熒光素酶活性明顯下降,驗證了miRNA-95-3p在SW620細胞中是與p21的3'-UTR相結合.

綜上所述,本研究驗證了miRNA-95-3p在結腸癌組織中的異常表達,并且異常表達的miRNA-95-3p參與了結腸癌細胞的增殖、遷移及凋亡等生物學行為的改變,提示miRNA-95-3p與結腸癌進程的參與性.因此,miRNA-95-3p很有可能可以成為結腸癌基因治療中的新靶點.從作用機制上來說,miRNA-95-3p可以直接結合單p21的3'-UTR區(qū)域對p21蛋白表達產生一定的影響,從而抑制結腸癌的進展.