喬玉玲 黃錚 秦海艷 宋蘭蘭 陳繼軍 安晨 葉星 毛曉燕

（1. 蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第四研究室 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州 730046；2. 上海泰因生物技術(shù)有限公司，上海 201499）

人類CD52屬于短鏈GH錨定糖蛋白家族，定位于人1號(hào)染色體（1p36.1）［1］，它廣泛分布于人淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等造血細(xì)胞上，其直接的生物學(xué)功能至今尚未明確，但是多組實(shí)驗(yàn)室及臨床數(shù)據(jù)顯示對(duì)其進(jìn)行人工干預(yù)及調(diào)控，可以治療和預(yù)防多種與淋巴細(xì)胞有關(guān)的疾?。?-4］。目前，全球上市藥品中，針對(duì)CD52抗原的主要是賽諾菲（Sano fi）旗下健贊（Genzyme）的單抗藥物L(fēng)emtrada（Alemtuzumab）。2013年9月，歐盟委員會(huì)（EC）批準(zhǔn)其用于活動(dòng)性復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥（RRMS）成人患者的治療。2014年11月FDA亦以相同的適應(yīng)癥批準(zhǔn)其在美國上市［5-7］。

由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司研制的抗人-CD52單克隆抗體是一種特異性中和人CD52的重組人源化IgG1治療性單克隆抗體。與小分子及化學(xué)藥物相比，單克隆抗體類藥物因?yàn)槠渖a(chǎn)的特殊性、自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及眾多的翻譯后糖基化修飾，需要對(duì)每批制品的抗體氨基酸序列進(jìn)行鑒定。而抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（Complementarity determining region，CDR）是每一個(gè)單克隆抗體所特有的氨基酸序列，也是抗體藥物與抗原產(chǎn)生特異性親和力的來源，所以，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)抗體的CDR區(qū)肽段進(jìn)行鑒別是對(duì)抗體生產(chǎn)的一種有效質(zhì)控方法。美國藥典藥物處方集、《中國藥典》2015版三部中“人用重組DNA蛋白制品總論”及“人用重組單克隆抗體產(chǎn)品總論”中均要求在制品的理化特性分析中應(yīng)盡可能地測定目標(biāo)產(chǎn)品的氨基酸序列，并與基因推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較［8-10］。HPLC-肽圖法原理是基于蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸胍變性、DTT打斷二硫鍵、烷基化封閉、使用蛋白酶消化成小分子肽段的混合物，再經(jīng)HPLC反向C18色譜柱分離后，應(yīng)用質(zhì)譜分析各個(gè)肽段的氨基酸序列。理論上每個(gè)不同蛋白消化后有不同的肽段，這些肽段的質(zhì)量（分子量）就是這個(gè)蛋白的肽指紋圖譜。

本論文探討了在抗人-CD52單克隆抗體生產(chǎn)質(zhì)控的過程中，使用胰蛋白酶在合適的條件下水解單抗，經(jīng)HPLC反向C18色譜柱分離后，在液質(zhì)聯(lián)用鑒別CDR區(qū)特征峰的基礎(chǔ)上，建立HPLC-肽圖法。用該方法對(duì)抗人CD52單抗進(jìn)行了肽圖分析，并對(duì)該方法按照《中國藥典》四部（2015年版）通則9101—藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行了專屬性、精密度、耐用性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

重組抗人CD52單克隆抗體（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第四研究室提供），三氟乙酸、乙腈、冰乙酸購自TEDIA公司；甲醇、二硫蘇糖醇、尿素購自Sigma公司；鹽酸胍購自Solarbio公司；十二水和磷酸氫二鈉、二水和磷酸二氫鈉購自國藥試劑；碘乙酸鈉購自BBI Lifescience公司；胰蛋白酶Trypsin購自Promega公司；10K超濾離心管、0.45 μm濾膜購自Millipore公司；Eclipse XDB-C18 4.6×250 mm 5 μm（Aglient）、進(jìn)樣瓶購自Agilent公司；液相色譜儀1260購自Agilent公司；Triple-TOF 5600+質(zhì)譜儀購自AB Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 酶切樣品制備 取300 μg重組抗人CD52單克隆抗體于6 mol/L鹽酸胍變性緩沖液中，加入1 μmol/L DTT，56℃反應(yīng) 30 min。 加 入 20 μmol/L IAM，37℃避光水浴反應(yīng)1 h。使用10K超濾濃縮管脫鹽置換至1.5 mol/L尿素緩沖液后，加入Trypsin 3μg，37℃水浴酶切18 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后加入20 μL 50%乙酸溶液終止反應(yīng)。

1.2.2 反相-HPLC檢測酶解產(chǎn)物 采用液相系統(tǒng)HPLC1260進(jìn)行分離。A液為0.1%TFA水溶液，B液為0.1%TFA乙腈溶液。色譜柱以A液平衡，A、B液梯度變化分離酶解產(chǎn)物。供試品酶解產(chǎn)物由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，上樣體積100 μL。紫外檢測波長214nm，柱溫30℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 供試品酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜脫鹽及分離后進(jìn)入Triple-TOF 5600+質(zhì)譜儀（AB Sciex）進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析。分析時(shí)長：135 min；檢測方式：正離子；TOF MS+掃描范圍：350-1 500 Da；Product Ion+掃描范圍：100-1 500 Da；質(zhì)譜分辨率：40 000；Exceeds：150 Cps。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù) 通過BioPharmaView V1.5（AB Sciex）進(jìn)行軟件分析，選擇供試品理論序列為數(shù)據(jù)庫，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫匹配檢索，分析參數(shù)如下：Enzyme，Trypsin；Fixed modification：Carbamidomethyl（C）；Modification：Oxidation（M），Deamidated（NQ），Protein terminal lys-loss，Gln-＞pyoGlu；M/Z tolerance：±20 ppm。

1.2.5 驗(yàn)證 用樣品處理專屬性驗(yàn)證樣品。輔料制劑溶液、樣品溶液、貝伐珠單抗溶液按照1.2.1至1.2.2方法進(jìn)行制備，0.1%TFA水溶液作為空白對(duì)照，各進(jìn)樣 100.0 μL。

精密度驗(yàn)證-儀器重復(fù)性樣品。按照1.2.1至1.2.2方法對(duì)同一批號(hào)樣品進(jìn)行制備，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6針，進(jìn)樣體積為100.0 μL。比較6次進(jìn)樣中目的峰片段的峰面積和保留時(shí)間，及其標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%（RSD%）。

精密度驗(yàn)證-樣品重復(fù)性樣品。1.2.1至1.2.2方法對(duì)同一批號(hào)樣品平行制備6份樣品，每份進(jìn)樣量為100.0 μL。比較6份平行樣品進(jìn)樣中目的峰片段的峰面積和保留時(shí)間，及其SD和RSD%。

精密度驗(yàn)證-中間精密度樣品。由同一人員在不同實(shí)驗(yàn)日期對(duì)同一批號(hào)樣品按照1.2.1至1.2.2方法進(jìn)行處理，由不同實(shí)驗(yàn)員在同天對(duì)同一批號(hào)樣品按照1.2.1至1.2.2方法處理。每針進(jìn)樣量為100.0 μL，集合3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別計(jì)算目的峰片段的保留時(shí)間和峰面積平均百分比，分別計(jì)算其SD和RSD%。

耐用性驗(yàn)證。考察柱溫變化2、不同胰蛋白酶量（使用同一批次，酶量分別為1.5 μg、3 μg、6 μg）、不同酶切條件（35℃、37℃、39℃）、不同酶切時(shí)間（16 h、18 h、20 h），酶切之后不同保存溫度不同保存時(shí)間（4℃1 d、2 d、3 d；-25℃1 d、2 d、3 d）。樣品制備同1.2.1至1.1.2。分別計(jì)算原條件與各考察因素下的目的峰片段峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 抗CD52單抗的CDR鑒別

抗CD52單抗為人源化IgG1單抗，由trypsin酶解單抗肽段得到的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過MASCOT數(shù)據(jù)搜索引擎獲得的氨基酸序列。其中輕鏈的覆蓋率為96%，重鏈的覆蓋率為 95%。將三批原液批號(hào)為DS201603001、DS201605002、DS201605003與 參 比品（批號(hào)RBP201508001）的肽圖結(jié)果重疊后如圖1所示。CDR特征肽段如表1所示。

參照2015版中國藥典要求，結(jié)合質(zhì)譜鑒定，確定在現(xiàn)有的前處理?xiàng)l件下該方法有較好的專屬性，可以對(duì)重組人源化抗CD52單克隆抗體進(jìn)行鑒定，并能夠鑒定出CDR區(qū)的特征肽段。

從質(zhì)譜結(jié)果推斷出部分特征肽段的保留時(shí)間，結(jié)合上述圖譜可以看出，連續(xù)生產(chǎn)的3批原液在Trypsin酶解后在液相圖譜上表現(xiàn)一致，且與參比品一致。3批原液CDR區(qū)的保留時(shí)間偏差均≤0.2min。因?yàn)橹劓淐DR1與輕鏈CDR1在HPLC色譜圖上豐度較低，故選擇重鏈CDR3及其他3個(gè)高豐度標(biāo)志性峰作為監(jiān)測點(diǎn)，其保留時(shí)間分別為：49.2±0.2，54.1±0.2，66.5±0.2。

2.2 HPLC-肽圖檢測方法驗(yàn)證結(jié)果

圖1 CD52單抗提取離子流色譜

表1 CD52單抗CDR對(duì)應(yīng)肽段及離子化信息

2.2.1 專屬性結(jié)果 輔料制劑圖譜（紅色）與樣品RBP201508001（紫色）用以評(píng)估輔料制劑是否對(duì)樣品測定造成干擾，流動(dòng)相A（深藍(lán)色）與貝伐珠單抗（綠色）、納武單抗（淺藍(lán)色）進(jìn)一步驗(yàn)證此方法的專屬性。圖2顯示樣品溶液在出峰位置均無干擾峰。

2.2.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果 精密度-儀器重復(fù)性結(jié)果：連續(xù)6次進(jìn)樣的肽圖數(shù)據(jù)（表2）顯示，目的峰峰面積的RSD%為2.4%-5.5%。且保留時(shí)間的RSD%為0.1%-0.2%，小于5%的可接受標(biāo)準(zhǔn)。該結(jié)果表明儀器的重復(fù)性良好，偏差屬于接受范圍內(nèi)。

圖2 專屬性色譜圖

精密度-樣品重復(fù)性結(jié)果：6份平行樣品的肽圖結(jié)果（表3）顯示，目標(biāo)峰的峰面積RSD%在1.7%-3.8%之間。目標(biāo)峰的保留時(shí)間RSD%在0.1%-0.2%，小于5%的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

精密度-中間精密度結(jié)果：兩分析人員3次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)（表4）顯示，目的峰峰面積的RSD%在4.8%-7.6%之間。目的峰保留時(shí)間的RSD%在0%-0.2%之間，小于5%的可接受標(biāo)準(zhǔn)。由此中間精密度在可接受范圍內(nèi)。

2.2.3 耐用性驗(yàn)證結(jié)果 不同酶量（1.5 μg、3 μg、6μg）、不同酶切溫度（35℃，37℃和39℃）和不同酶切時(shí)間（16 h，18 h，20 h）、酶切后4℃及-25℃分別保存24 h、48 h、72 h后考察目標(biāo)峰保留時(shí)間RSD%均小于5%的可接受標(biāo)準(zhǔn)。所有考察條件下發(fā)現(xiàn)3 μg胰蛋白酶、37℃和18 h的酶切條件是最合適樣品處理?xiàng)l件。72 h內(nèi)，酶切后樣品4℃及-25℃保存條件下，目標(biāo)峰保留時(shí)間RSD%無明顯差異。綜上，各考察條件下目的峰的出峰時(shí)間與原條件相比，在±1 min范圍內(nèi)且對(duì)各目的峰保留時(shí)間影響較小，因此該方法耐用性良好。結(jié)果見表5至表9。

表2 儀器重復(fù)性結(jié)果

3 討論

本研究旨在建立基于質(zhì)譜檢測結(jié)果的HPLC-肽圖法，用于抗CD52單抗的鑒別實(shí)驗(yàn)?？贵w經(jīng)胰蛋白酶酶解后，使用HPLC反相C18色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離后質(zhì)譜檢測，在方法建立過程中，我們分別使用 Eclipse XDB-C184.6×150 mm 5 μm、4.6×250 mm 5 μm（Aglient）色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分析，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，4.6×250 mm 5 μm色譜柱對(duì)本單抗制品分離效果更好，能有效的對(duì)CDR特征峰進(jìn)行分離，效費(fèi)比更高。

表3 樣品重復(fù)性結(jié)果

表4 中間精密度結(jié)果

表5 不同胰蛋白酶量的測定結(jié)果

表6 不同酶切反應(yīng)溫度的測定結(jié)果

在前期的試驗(yàn)中，我們還對(duì)不同的內(nèi)切酶進(jìn)行了驗(yàn)證，分別選取了胰蛋白酶、糖苷酶、糜蛋白酶對(duì)抗CD52單抗進(jìn)行酶切分析，結(jié)果顯示胰蛋白酶對(duì)特征CDR區(qū)的酶切效果最好，得到了3個(gè)CDR區(qū)的特征峰，分別表征重鏈的CDR1、CDR3及輕鏈的CDR1。但是，仍不能對(duì)抗體全部的6個(gè)CDR區(qū)進(jìn)行全覆蓋。傳統(tǒng)檢測方法中使用液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)對(duì)抗體氨基酸序列進(jìn)行分析，但是既耗時(shí)耗力且不利于抗體生產(chǎn)過程中的常規(guī)檢測。所以我們選擇在HPLC色譜中豐度較高的重鏈CDR3特征峰及其他3個(gè)高豐度且特異性良好的特征峰作為判斷標(biāo)準(zhǔn)［11-13］，建立了HPLC-肽圖法。經(jīng)驗(yàn)證該方法專屬性好，輔料成分、異種抗體及樣品處理中所用的試劑對(duì)檢測結(jié)果均無干擾，且其色譜峰積分面積小于樣品總峰面積的1%；精密度良好，保留時(shí)間的RSD%均小于5%；耐用性良好，各考察條件下目的峰保留時(shí)間RSD%均在5%的可接受范圍內(nèi)。

表7 不同酶切反應(yīng)時(shí)間的測定結(jié)果

表8 酶切后4℃保存條件下的測定結(jié)果

表9 酶切后-25℃保存條件下的測定結(jié)果

后期，我們將嘗試使用上述3種內(nèi)切酶混合的方式對(duì)抗體進(jìn)行酶切處理，期望在HPLC-肽圖的結(jié)果上所有6個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列與對(duì)應(yīng)的特征峰覆蓋率達(dá)到100%。

4 結(jié)論

本研究建立了HPLC-肽圖法用于抗CD52單抗生產(chǎn)中的鑒別試驗(yàn)。該方法經(jīng)驗(yàn)證具有良好的專屬性、精密度及耐用性，酶解后樣品能保證一定的穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的質(zhì)譜法相比，此方法不需要解譜及繁瑣的數(shù)據(jù)處理，僅需比對(duì)特征峰的保留時(shí)間及峰面積，簡化了實(shí)驗(yàn)操作?？捎糜趩慰沟娜粘Ｙ|(zhì)量控制及批檢驗(yàn)放行中。