付加芳 張佩佩 宗工理 王新圓 劉萌 曹廣祥

（1. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟南 250062；2. 山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南250100）

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是肺結(jié)核病的病原菌，攜帶人口數(shù)約占全世界總?cè)丝诘?/4，結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性菌株的發(fā)病率已經(jīng)接近10%［1］，因此結(jié)核病的預防和治療面臨嚴峻挑戰(zhàn)。研究表明，結(jié)核分枝桿菌的致病性與其分泌蛋白有關(guān)，分泌蛋白參與了病原菌與宿主之間的相互作用，在結(jié)核分枝桿菌侵入、潛伏和致病等方面扮演著重要的角色。Type VII分泌系統(tǒng)是在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng)，包括ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-4和ESX-5等，負責一些與致病性有關(guān)的蛋白質(zhì)分泌［2］。例如，ESX-1系統(tǒng)負責分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，ESAT-6是在感染早期分泌的主要抗原蛋白，能夠抑制巨噬細胞的自噬功能，幫助結(jié)核分枝桿菌從溶酶體逃逸到細胞質(zhì)，誘導巨噬細胞的凋亡［3-6］；而ESX-5系統(tǒng)負責分泌PE和PPE大分子蛋白，PE和PPE與細菌免疫原性有關(guān)，參與了修飾巨噬細胞成熟化、誘導促炎癥因子IL-1β表達和誘導巨噬細胞死亡等過程［7-8］。

結(jié)核分枝桿菌有一層由分枝菌酸組成的外膜，在細菌表面形成通透性屏障阻礙蛋白質(zhì)的分泌，現(xiàn)在還不清楚其外膜運輸機制，例如ESX-1的外膜運輸通道［9］。Rv1057是結(jié)核分枝桿菌中唯一的7-折疊片β-螺旋蛋白，β-螺旋蛋白具有典型的筒狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，生物功能包括轉(zhuǎn)運蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白和細胞膜蛋白等［10］。結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的生長早期大量合成Rv1057，而生長后期幾乎檢測不到Rv1057［11］。此外，敲除rv1057基因會顯著降低ESAT-6的分泌［12］，說明Rv1057可能參與了結(jié)核分枝桿菌的早期感染過程。

rv1057基因存在復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其上游基因間隔區(qū)域具有1 003個堿基。前期研究顯示rv1057基因受到雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Two-component regulatory system，TCS）MprAB和 TrcRS的 調(diào) 控，應答調(diào)控蛋白TrcR可以結(jié)合rv1057啟動子區(qū)域中富含AT堿基的序列［11］，MprA在rv1057啟動子區(qū)域有多個結(jié)合位點［13］。MprA是激活rv1057轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，TrcR則是阻遏rv1057轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子［14］。

原核生物染色體形成直徑僅數(shù)微米的擬核結(jié)構(gòu)，由一系列擬核結(jié)合蛋白（Nucleoid-associated proteins，NAPs）維持，Lsr2是革蘭氏陽性菌中第一個被發(fā)現(xiàn)的擬核結(jié)合蛋白［15］，在低氧、營養(yǎng)缺乏等壓力條件下，lsr2基因表達明顯上調(diào)，并通過與DNA結(jié)合形成物理屏障，協(xié)助細菌對抗損傷［16］。研究發(fā)現(xiàn)Lsr2在結(jié)核分枝桿菌基因組上有數(shù)百個結(jié)合位點，說明Lsr2能發(fā)揮全局性調(diào)控作用［17］。我們預測Lsr2可能是rv1057基因轉(zhuǎn)錄的一個阻遏蛋白，本研究通過凝膠阻滯遷移試驗（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）分析和轉(zhuǎn)錄水平分析解析了Lsr2對rv1057基因的調(diào)控方式，研究結(jié)果可為闡明Rv1057的生物學功能提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 結(jié)核分枝桿菌野生型菌株H37Rv為本實驗室保存，△lsr2突變菌株為Voskuil MI饋贈［16］。大腸桿菌 DH5α和 BL21（DE3）購自碧云天生物技術(shù)公司。pEASY-Blunt載體購自全式金生物技術(shù)公司。攜帶無啟動子lacZ報告基因的pSM128載體和表達載體pET15b為本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑 7H9、7H10、OADC、胰蛋白胨、酵母提取物購自美國Difco公司，［γ-32P］ATP 購自美國PerkinElmer公司，T4 Polynucleotide Kinase購自美國Promega公司，Silica/Ceramic Beads購自美國MP公司，M-MLV購自Thermo公司，SYBR Premix EX Taq購自大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 重組Lsr2蛋白和TrcR蛋白的表達與純化 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，用PCR擴增Lsr2蛋白的編碼基因，連接到pEASY-Blunt組成pBlunt-Lsr2，并進行DNA測序驗證。測序正確后用NdeI和XhoI進行酶切，切下的片段連接到pET15b質(zhì)粒構(gòu)建重組表達載體pET15b-Lsr2。然后將pET15b-Lsr2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導和Ni-NTA 柱（Sangon）純化獲得重組Lsr2蛋白，純化的重組Lsr2蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和濃度檢測后備用。TrcR蛋白用已報道的方法進行制備［14］。Lsr2編碼基因的PCR擴增引物為：Lsr2-15b-F：CATATGGCGAAGAAAGTAACCGTCACCT和 Lsr2-15b-R：CTCAGATCAGGTCGCCGCGTGGTATGCGTC。

1.2.2 EMSA分析Lsr2蛋白與rv1057啟動子片段的結(jié)合情況 EMSA試驗按照已報道的方法進行［14］。首先采用 Rv1057-ForN/Rv1057-RevN 引物PCR擴增含Lsr2結(jié)合位點的rv1057基因的255 bp（-503 - -249）啟動子片段，并用［γ-32P］ATP和T4 Polynucleotide Kinase進行末端標記，然后與適量Lsr2蛋白溶液溫育，8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，最后用X-膠片曝光。

采用同樣的方法分析Lsr2蛋白、TrcR蛋白與帶突變位點啟動子序列的結(jié)合情況，帶突變位點的81 bp啟動子序列采用化學合成獲得。rv1057基因啟動子片段的PCR擴增引物為Rv1057-ForN：TGACCACTAACCAGTCTCATCG，Rv1057-RevN：GGTATGTGGCAAACCAGTGCTA。

1.2.3 啟動子-lacZ報告基因菌株構(gòu)建和lacZ基因轉(zhuǎn)錄水平分析 報告基因菌株構(gòu)建按照已報道的方法進行［12］。采用重疊PCR擴增不同區(qū)域和帶突變位點的rv1057啟動子片段，連接到中間載體并測序驗證，然后連接到pSM128載體上，構(gòu)建啟動子-lacZ融合載體。重組質(zhì)粒和pSM128空質(zhì)粒通過Gene PulserXcell（BioRad）電擊轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)入H37Rv菌株，用50 μg/mL鏈霉素篩選轉(zhuǎn)化子并用PCR進行驗證。

將導入不同重組pSM128質(zhì)粒的H37Rv菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后接入新鮮7H9/OADC培養(yǎng)基中并加入0.05%十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），分別在第24 h，48 h和120 h收集菌體，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用熒光實時定量PCR（qRT-PCR）分析基因轉(zhuǎn)錄水平，試驗重復3次。用不加模板的樣品作為陰性對照，并用看家基因16S rRNA作為內(nèi)標校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。

lacZ融合載體構(gòu)建的PCR擴增引物：Rv1057-fusFor1：TGATCACTAGTGCTTGGTTTGTTCGCCG，Rv1057-fusRev1：TGATCAGCGCCGCTCCTCCTCATCA。lacZ基因上游：CCTGAGGCCGATACTGTCGT，下 游：TTGGTGTAGATGGGCGCAT；16S rRNA基因上游：TCCCGG GCCTTGTACACA，下游：CCACT-GGCTTCGGGTGTTA。

1.2.4 △lsr2突變菌株中Rv1057蛋白表達分析 將H37Rv和△lsr2突變菌株培養(yǎng)到對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)接到新鮮7H9/OADC培養(yǎng)基中并加入0.05% SDS，并在37℃水平搖床上晃動培養(yǎng)，分別在第24 h，第48h和120 h離心收集菌體。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用qRT-PCR分析lsr2基因轉(zhuǎn)錄水平。用不加模板的樣品作為陰性對照，并用看家基因16S rRNA作為內(nèi)標校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。同時用FastPrep（MP）振蕩破碎菌體，離心收集上清，制備菌體蛋白。菌體蛋白按照以前的方法進行Western blot檢測［14］，檢測Rv1057蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 Lsr2對rv1057啟動子的結(jié)合分析

Lsr2是一個擬核結(jié)合蛋白，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)rv1057啟動子中有一個可能的Lsr2結(jié)合區(qū)域。

EMSA實驗結(jié)果（圖1-A）顯示，重組Lsr2蛋白在體外條件下可以特異性地結(jié)合rv1057啟動子片段，提高Lsr2蛋白用量時阻滯效應更加明顯，而過量的非標記rv1057啟動子片段能夠?qū)擞浀膔v1057啟動子片段從Lsr2蛋白上競爭性解離下來，表明Lsr2可以結(jié)合rv1057的啟動子。與此同時，TrcR也結(jié)合該啟動子片段，而且同時加入Lsr2和TrcR蛋白產(chǎn)生2條阻滯條帶（圖1-B），說明Lsr2和TrcR都能夠結(jié)合rv1057啟動子。

我們進一步設(shè)計了可能含突變TrcR或Lsr2結(jié)合位點的啟動子序列M1-M4（圖1-E），結(jié)果（圖1-C和1-D）顯示Lsr2和TrcR結(jié)合野生型rv1057啟動子片段和M1片段，僅Lsr2能結(jié)合而TrcR不結(jié)合M2片段，僅TrcR能結(jié)合而Lsr2不結(jié)合M4片段，Lsr2和TrcR都不能結(jié)合M3片段。

2.2 Lsr2和TrcR對rv1057啟動子的調(diào)控分析

本研究構(gòu)建了含有野生型和突變型rv1057啟動子的pSM128重組載體，分析rv1057啟動子上Lsr2結(jié)合位點對報告基因lacZ轉(zhuǎn)錄的影響。

qRT-PCR結(jié)果（圖2）顯示，包含完整rv1057啟動子的P1 可以正常轉(zhuǎn)錄報告基因lacZ，但第120小時lacZ轉(zhuǎn)錄水受明顯受到抑制，第24小時lacZ表達量為第120小時lacZ表達量的6.25倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=27.84，P＜0.05）；缺失Lsr2結(jié)合位點的P1-M4啟動子也能正常激活lacZ的轉(zhuǎn)錄，但第120小時lacZ轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型rv1057啟動子，是野生型啟動子的8.94倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.54，P＜0.05）；缺失TrcR結(jié)合位點（P1-M2）時lacZ轉(zhuǎn)錄水平在第24小時明顯升高，第120小時與野生型rv1057啟動子無明顯差異；而同時缺失Lsr2和TrcR結(jié)合位點（P1-M3）時，lacZ轉(zhuǎn)錄水在第24小時和第120小時都顯著高于野生型rv1057啟動子，差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為8.61和20.23，P＜0.05）。

圖1 Lsr2和TrcR結(jié)合rv1057啟動子的EMSA分析

報告基因轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果說明TrcR可能在感染早期發(fā)揮阻遏作用，而Lsr2可能在感染的中后期發(fā)揮阻遏作用。

圖2 突變Lsr2位點對rv1057啟動子的調(diào)控作用

2.3 Lsr2對rv1057表達的影響分析

為進一步研究在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)Lsr2對rv1057表達的影響，本研究采用qRT-PCR分析H37Rv和△lsr2突變菌株中trcR和lsr2轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，并用Western blot分析Rv1057蛋白的表達情況。

qRT-PCR分析結(jié)果（圖3-A）顯示，培養(yǎng)24 h H37Rv菌株中l(wèi)sr2轉(zhuǎn)錄水平較低，而第48小時和120 h的lsr2轉(zhuǎn)錄水平基本一致，分別是24 h的5.03倍和4.53倍，差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為24.44、16.86，P＜0.05）；但是在H37Rv菌株中trcR轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢與lsr2轉(zhuǎn)錄水平相反，第24小時的trcR轉(zhuǎn)錄水平是第48小時的4.86倍，是第120小時的10.03倍（圖3-B），差異具有統(tǒng)計學意義（t值分別為6.79、10.16，P＜0.05）?！鱨sr2突變菌株中trcR轉(zhuǎn)錄變化趨勢與H37Rv菌株基本一致（圖3-B）。以上實驗結(jié)果說明TrcR主要在結(jié)核分枝桿菌生長早期表達，而Lsr2在結(jié)核分枝桿菌生長中后期表達。

Western blot分析結(jié)果（圖4），顯示，H37Rv菌株中Rv1057在培養(yǎng)24 h和48 h的表達量較高，培養(yǎng)120 h Rv1057表達量非常少，而△lsr2突變菌株在培養(yǎng)120 h的Rv1057表達量較高，說明Lsr2在結(jié)核分枝桿菌生長中后期抑制Rv1057的表達，與qRT-PCR試驗的分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明Lsr2是rv1057基因的負調(diào)控因子，在結(jié)核分枝桿菌生長的中后期阻遏rv1057基因的表達。

圖3 lsr2和trcR轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析

綜合上述試驗結(jié)果，本研究進一步完善了rvl057轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模型：Lsr2和TrcR都是阻遏調(diào)控蛋白，MprA是激活調(diào)控蛋白；在結(jié)核分枝桿菌生長早期，TrcR結(jié)合rvl057啟動子并阻礙rvl057的轉(zhuǎn)錄，當受到環(huán)境條件壓力后MprA激活rvl057的轉(zhuǎn)錄并阻遏trcR表達，而隨著時間的延長結(jié)核分枝桿菌開始表達Lsr2并阻礙rvl057的表達。

圖4 H37Rv和△lsr2突變菌株中Rv1057蛋白的表達分析

3 討論

Rv1057是一個7-折疊片β-螺旋蛋白，這類β-螺旋蛋白在細菌中具有功能多樣性［10］。我們前期發(fā)現(xiàn)敲除rv1057基因影響結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的存活率［18］，以及 ESAT-6和 CFP-10的分泌［12］，說明rv1057可能影響結(jié)核分枝桿菌感染早期與巨噬細胞之間的應答，參與結(jié)核分枝桿菌與宿主之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示在抑制細胞合成藥物萬古霉素的壓力下rv1057轉(zhuǎn)錄水平上升［19］；Western blot檢測顯示在感染巨噬細胞的早期大量表達Rv1057，但感染后期檢測不到Rv1057［11］；我們課題組前期研究則表明Rv1057在結(jié)核分枝桿菌受到細胞膜壓力誘導（例如SDS或Triton X-100）的情況下被大量表達［13］，而且MprAB和TrcRS雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)同時參與rv1057的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［13，18］，這些研究結(jié)果提示rv1057受到了非常精細和復雜的調(diào)控作用。

Lsr2是一個擬核結(jié)合蛋白，在革蘭氏陽性菌中廣泛存在［15］。染色質(zhì)免疫共沉淀和基因表達芯片實驗表明，Lsr2能夠結(jié)合基因組的高AT含量區(qū)域并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［17］。研究顯示，TrcR和Lsr2都結(jié)合富含AT堿基的DNA序列，但是TrcR和Lsr2的結(jié)合位點不同，Lsr2的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合在高AT含量區(qū)域的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)小溝，沿DNA小溝方向伸展并覆蓋約5個AT堿基序列［20］。rv1057啟動子存在高AT含量區(qū)域，研究顯示TrcR結(jié)合rv1057啟動子的高AT區(qū)域，并且阻遏rv1057的轉(zhuǎn)錄［11］。本研究證實Lsr2也結(jié)合rv1057啟動子的高AT區(qū)域，與TrcR均可阻遏rv1057的轉(zhuǎn)錄，但兩者在不同的生長時期發(fā)揮阻遏作用。本研究發(fā)現(xiàn)H37Rv菌株中Rv1057在培養(yǎng)48 h的表達量較24 h的表達量有所升高（圖4），暗示rv1057除了受到Lsr2和TrcR的調(diào)控，還受到其它調(diào)控因子（比如MprAB雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)）的調(diào)控，說明rv1057的表達受到非常精細和復雜的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Lsr2結(jié)合rv1057啟動子的高AT含量區(qū)域，和TrcR均可阻遏rv1057基因的表達。但TrcR在誘導條件下可以完全阻遏rv1057基因的表達，而Lsr2可能起到基礎(chǔ)阻遏作用，不能完全封閉rv1057基因的表達。

4 結(jié)論

本研究通過凝膠阻滯遷移實驗、熒光定量PCR實驗和Western blot實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌擬核結(jié)合蛋白 Lsr2是rv1057基因轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白，并且與已知的阻遏蛋白TrcR均可調(diào)控rv1057基因的表達；Lsr2在結(jié)核分枝桿菌生長周期的中后期大量表達并阻遏rv1057的轉(zhuǎn)錄，TrcR則在結(jié)核分枝桿菌生長周期的早期阻遏rv1057的轉(zhuǎn)錄。