陳少威 吳程 蘇月華 蔡斌斌 謝盼盼 楊梅

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117）

大多數(shù)植物病原體是革蘭氏陰性細菌［1］，其自身代謝產(chǎn)物N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-Acylhomoserine lactones，AHLs）已被證明是參與群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)中關(guān)鍵的信號分子。細菌能通過QS系統(tǒng)感知菌群密度并調(diào)節(jié)其生理活動［2］，當(dāng)菌群中AHLs濃度達到一定閾值后，就能激活病原菌致病基因表達，使動植物出現(xiàn)致病性，如參與病原體和植物之間相互作用的毒力因子［3-4］。因此，科學(xué)家提出了一種植物病原體控制策略，即破壞病原體的QS系統(tǒng)可能下調(diào)菌群密度，從而抑制可能感染宿主植物的毒力因子的表達。

當(dāng)前對N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶（N-acylhomoserine Lactonase，AiiA蛋白）編碼基因aiiA的研究大部分側(cè)重于對其進行克隆表達。蘇云金芽胞桿菌aiiA編碼的AiiA蛋白，通過水解內(nèi)酯鍵失活A(yù)HLs，從而破壞AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)［5-6］。有研究表明，在微生物中，蠟狀芽孢桿菌AiiA蛋白對魔芋軟腐病菌 CZY 表現(xiàn)出較強的抗病活性［7］；álvaro等［8］分離到一株蘇云金芽胞桿菌，克隆其aiiA并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)重組的大腸桿菌在含有歐文氏桿菌的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)時，可以干擾AHLs信號的積累或響應(yīng)，破壞其QS系統(tǒng)，這與Wu等［9］從蘇云金芽胞桿菌中克隆到的aiiA在畢赤酵母GS115中表達，其提取物表現(xiàn)出對歐文氏桿菌的抗菌活性有相似之處。同時，有學(xué)者將aiiA轉(zhuǎn)化到巨尾桉中后，用青枯雷爾氏菌侵染植株后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的巨尾桉出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象的時間顯著延遲，發(fā)病率降低，表明轉(zhuǎn)入aiiA能增強其抗青枯病能力［10］。同樣，將在巴斯德畢赤酵母中異源表達的AiiA蛋白與嗜水氣單胞菌的同時注射進鯉魚時，其死亡率與單獨注射嗜水氣單胞菌相比，降低了約25%［11］。因此，使用AiiA蛋白破壞QS系統(tǒng)被認為是生物防治病害的有效手段。然而，aiiA在蘇云金芽胞桿菌中的表達非常低，對aiiA啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究很少。因此，研究aiiA的轉(zhuǎn)錄機制可能是增強AiiA蛋白表達量的有效方法，啟動子區(qū)域的尋找是研究轉(zhuǎn)錄機制的第一步。

本研究通過克隆aiiA的5'側(cè)翼區(qū)域，利用在線生物軟件分析潛在的啟動子區(qū)域。以gfp作為報告基因，通過分段克隆及定點突變，對aiiA的5'端側(cè)翼序列的啟動子功能進行研究。分析蘇云金芽胞桿菌aiiA啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，為aiiA在不同宿主中的高表達提供理論基礎(chǔ)，也為細菌病害的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工程研究中心保存，蘇云金芽胞桿菌BRC-ZLL5（Bacillus thuringiensis）由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院關(guān)雄教授惠贈。蘇云金芽胞桿菌aiiA由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工程研究中心前期克隆得到。所有菌株均用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒pET28a-gfp以及由pET28agfp質(zhì)粒敲除T7啟動子改造而來的綠色熒光蛋白本底表達質(zhì)粒pET28a-dP-gfp由福建師范大學(xué)發(fā)育生物學(xué)重點實驗室保存，pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'端側(cè)翼序列的克隆 將克隆的aiiA（GenBank登錄號：DQ440581.1）在NCBI網(wǎng)站進行BLAST檢索，選擇同源性最高的蘇云金芽胞桿菌全基因組序列（GenBank登錄號：CP001903.1），在aiiA起始密碼子ATG上游1 900 bp處設(shè)計特異性PCR擴增引物，上游引物P1插入BglⅡ 酶切位點：5'-GAAGATCTAGC TAGTGTAAAATGACGTTTGCTT-3'；下游引物P2插入NheⅠ酶切位點：5'-CTAGCTAGCTATGTA TCCACCTTTACATTTAGTT-3'（下劃線處堿基為限制性內(nèi)切酶識別位點）。此外，在aiiA起始密碼子ATG下游200 bp處設(shè)計另一條下游引物P3：5'-GTACCGTTAAAAAGCCCTTCATTAT-3'，可以克隆出一條既包含aiiA的5'端側(cè)翼序列，又包含200 bpaiiA的目的序列。本研究引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

為擴增aiiA的5'端側(cè)翼，使用分子克隆方法提取蘇云金芽胞桿菌的質(zhì)粒［12］，進行PCR擴增，擴增體系為模板 DNA 1 μL、dNTP 0.5 μL、10×buffer 1.5 μL、引物各 0.5μL、ExTaq 酶 0.15 μL 和 ddH2O 10.9 μL。反應(yīng)條件為 94℃ 5 min ；94℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收、連接和轉(zhuǎn)化。篩選陽性克隆測序。插入aiiA的5'端側(cè)翼區(qū)的質(zhì)粒pMD18-T命名為pMD18-T-aP-1930-+200。

1.2.2 蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'端側(cè)翼序列aP-1930-+200啟動子區(qū)域分析 使用在線軟件BDGP Neural Network Promoter Prediction，V2.2（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）、Promoter 2.0Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和NCBI 中Finding Promoter數(shù)據(jù)庫預(yù)測aiiA的5'端側(cè)翼序列可能的啟動子區(qū)域。

1.2.3 蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'端側(cè)翼序列的分段克隆 以克隆的側(cè)翼序列aP-1930-+200為模板，根據(jù)啟動子潛在區(qū)域預(yù)測結(jié)果，在aiiA的5'端側(cè)翼序列的不同位置設(shè)計10對引物（表1），進行分段克隆。上游引物加入BglⅡ酶切位點，下游引物加入NheⅠ酶切位點。

表1 aiiA的克隆引物

以pMD18-T-aP-1930-+200質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。擴增體系同1.2.1。其中片段aP-100--1、aP-295--1、aP-429--1、aP-429--296和aP-295--101的 PCR 反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循 環(huán) ；72℃ 10 min；片 段aP-531--1和aP-1930--1430的PCR 反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán) ；72℃ 10 min；片段aP-1031--1、aP-1531--1和aP-1931-1的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán) ；72℃10 min。

1.2.4 啟動子功能鑒定載體pET28a-aP-x-gfp的構(gòu)建 將aiiA的5'端側(cè)翼序列的分段克隆與經(jīng)BglⅡ和NheⅠ雙酶切的pET28a-gfp質(zhì)粒用T4 DNA連接酶16℃ 過夜連接，然后將連接的pET28a-aP-x-gfp載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，并命名為E.coliBL21（DE3）-pET28a-aP-x-gfp。

1.2.5aiiA的5'端側(cè)翼區(qū)域的啟動子活性分析 將重組大腸桿菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-aP-x-gfp在50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩孵育過夜。當(dāng)細菌濃度達到OD600=0.6-0.8時，向培養(yǎng)基中加入IPTG（終濃度1.0 mmol/L）。取5 μL菌液制成玻片標本后，直接用熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光為藍光），通過熒光強度比較啟動子的活性。大腸桿菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-gfp、E.coliBL21（DE3）-pET28a-dP-gfp分別作為陽性對照和陰性對照。取3.5 mL上述誘導(dǎo)過的菌液于熒光比色皿中，利用熒光分光光度計在激發(fā)光波長（Ex）為491 nm、發(fā)色光波長（Em）為509 nm下測量菌液熒光強度。

1.2.6 蘇云金芽胞桿菌aiiA基因啟動子的定點突變 在載體pET28a-aP-295--101-gfp基礎(chǔ)上，對aiiA啟動子-150--142 bp的2個TATA序列進行點突變，結(jié)合待突變位點設(shè)計4對引物（表2）：前2對為-144和-147位點處的單點突變引物，第3對為-144位和-147位點處的雙點突變引物，第4對為2個TATA序列缺失突變引物。

表2 突變引物

定點突變PCR擴增體系為模板DNA 0.4 μL、dNTP Mixture 1.6 μL、5×Prime STAR buffer 4.0 μL、引物各 0.4 μL、Prime STAR HS DNA Polymerase 0.2 μL和ddH2O 13.0 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 7 min，30 個循環(huán) ；72℃10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后，冰浴2-3 min，向反應(yīng)物中加入1 μLDpnⅠ酶，消化模板質(zhì)粒pET28a-aP-295--101-gfp，37℃ 水浴過夜后熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞。

通過DNA測序鑒定陽性誘變菌株，通過熒光顯微鏡和熒光分光光度法分析含有突變的5'側(cè)翼突變區(qū)域的重組菌株。

2 結(jié)果

2.1 aiiA的5'端側(cè)翼序列的克隆與分析

以蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒DNA為模板，用引物P1和P2、P1和P3進行擴增，獲得約1.9和2.1 kb大小片段。將2.1 kb片段測序結(jié)果進行在線BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），結(jié)果顯示克隆的aiiA的5’端側(cè)翼序列與已經(jīng)公布的蘇云金芽胞桿菌YBT-1520（GenBank登 錄 號：CP007607.1）aiiA的5’端側(cè)翼序列同源性為100%，其中3’端的200 bp與aiiA的5’端同源性為100%（GenBank登錄號：DQ000642.1）。所克隆的片段在GenBank登錄號為KP690195。

利用在線分析軟件BDGP Neural Network Promoter Prediction對aiiA的5’端側(cè)翼序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有潛在的啟動子區(qū)域（圖1紅色區(qū)域），其中位于-1 395--1 346 bp和-339--292 bp處的啟動子區(qū)域可靠性最高，分值均為滿分1.0；通過NCBI中Finding Promoter數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其可能存在2個啟動子區(qū)域（圖1下劃線區(qū)域），分別位于-429--1 bp和-1 930--1 822 bp處。此外，在序列-150--142 bp處還存在2個連續(xù)的TATA序列，可能對啟動子活性有很重要的作用。

2.2 aiiA的5'端側(cè)翼序列的啟動子活性鑒定

以pMD18-T-aP-1930-+200質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳（圖2）可知在100、295、134、429、195、501、531、1 031、1 531 和 1 930 bp處出現(xiàn)目的條帶，PCR擴增產(chǎn)物與目的片段大小一致，產(chǎn)物特異性好。

由模板質(zhì)粒pET28a-dP-gfp構(gòu)建而來的分段克隆載 體 pET28a-aP-x-gfp（pET28a-aP-100--1-gfp、pET28aaP-295--1-gfp、pET28a-aP-295--101-gfp、pET28a-aP-429--1-gfp、pET28a-aP-429--296-gfp、pET28a-aP-531--1-gfp、pET28aaP-1031--1-gfp、pET28a-aP-1531--1-gfp、pET28a-aP-1930--1-gfp和pET28a-aP-1930--1429-gfp）經(jīng)過雙酶切（BglⅡ和NdeⅠ）和DNA測序鑒定，10個克隆子均顯示了正確的條帶，構(gòu)建的載體經(jīng)上海生工生物股份有限公司序列測定后表明插入序列與目的序列相同，表明載體 pET28a-aP-295--101-gfp、pET28a-aP-100--1-gfp、pET28a-aP-429--296-gfp、pET28a-aP-429--1-gfp、pET28aaP-295--1-gfp、pET28a-aP-531--1-gfp、pET28a-aP-1531--1-gfp、pET28a-aP-1031--1-gfp、pET28a-aP-1930--1429-gfp和pET28a-aP-1930--1-gfp構(gòu)建成功。

培養(yǎng)含有pET28a-aP-x-gfp載體的重組大腸桿菌菌株，使用熒光顯微鏡和熒光分光光度計分析啟動子活性。熒光顯微鏡（圖3）顯示大腸桿菌菌株BL21（DE3）-pET28a-aP-1930--1429-gfp，BL21（DE3）-pET28a-aP-295--1-gfp和BL21（DE3）-pET28a-aP-295--101-gfp能夠產(chǎn)生綠色熒光，表明aiiA的5'側(cè)翼區(qū)域aP-1930中的aP-1930-1429、aP-295--1和aP-295--101具有啟動子活性，其中aP-1930--1429和aP-295--101區(qū)域熒光強度最高。

熒光分光光度法進行定量分析（圖4）顯示BL21（DE3）-pET28a-aP-1930--1429-gfp菌株啟動子活性最高，其次是BL21（DE3）-pET28a-aP-295--101-gfp菌株，BL21（DE3）-pET28a-aP-295--1-gfp菌株啟動子活性相對較低。

2.3 定點突變對蘇云金芽胞菌aiiA的5'端側(cè)翼區(qū)域啟動子活性的影響

以pET28a-aP-295--101-gfp質(zhì)粒為模板進行定點突變，測序結(jié)果顯示缺失突變質(zhì)粒序列TATA盒被成功去除，點突變質(zhì)粒-144位和-147位堿基均由A突變?yōu)镚，但雙點突變質(zhì)粒除了預(yù)定的-144位點和-147位點發(fā)生突變外，-163位點也發(fā)生了突變，由A變?yōu)門，序列分析表明，-163不在啟動子潛在區(qū)域內(nèi)。

熒光顯微鏡觀察顯示（圖5），相對于野生型菌株（BL21（DE3）-pET28a-aP-295--101-gfp），所有的定點突變菌株的啟動子活性均顯著降低。熒光分光光度計測定結(jié)果（圖6）表明，雙點突變（P-295--101（-144、-147Mu））和 2 個 TATA 盒缺失（P-295--101（-116--134dMu））比單點突變（P-295--101（-144 Mu）和P-295--101（-147 Mu））引起的啟動子活性降低幅度更大，提示蘇云金芽胞桿菌aiiA啟動子-150--142 bp區(qū)域的2個TATA盒對aiiA的5'端側(cè)翼區(qū)域的啟動子活性可能起著很關(guān)鍵的作用。

圖1 aiiA的5'端側(cè)翼序列

圖2 aiiA的5'端側(cè)翼序列的亞克隆

3 討論

將AiiA蛋白運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，提高aiiA的轉(zhuǎn)錄水平是至關(guān)重要的一步。有研究表明將蘇云金芽胞桿菌cry3Aa的啟動子用于啟動aiiA，可以提高aiiA的表達，增加AiiA蛋白的產(chǎn)量［13］。一些報告基因，如綠色熒光蛋白，常用于研究啟動子功能活性的鑒定［14-15］。本實驗為研究aiiA的啟動子活性，克隆了蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'側(cè)翼序列（aP-1930--1），通過熒光顯微鏡和熒光分光光度計對aiiA的5'端側(cè)翼序列的功能進行定性和定量分析，根據(jù)報告基因GFP的熒光強度分析表明，分段克隆到的側(cè)翼序列aP-295--101、aP-295--1和aP-1930--1429均具有啟動子活性，這與通過生物信息學(xué)分析其啟動子潛在區(qū)域結(jié)果一致，但序列aP-1930--1不具備啟動子功能。此外，通過在NCBI上BLAST比對發(fā)現(xiàn)序列-1 821--1430 bp區(qū)域是氨基酸通透性酶家族蛋白（Amino acid permease family protein）基因的編碼區(qū)，表明aiiA的5'端-1 930--1 429 bp區(qū)不是aiiA啟動子，在蘇云金芽胞桿菌中一個啟動子同時啟動兩個基因表達的可能性不大。分段克隆分析顯示側(cè)翼序列aP-295--101的啟動子活性比aP-295--1強，而且aP-100--1序列沒有啟動GFP轉(zhuǎn)錄的能力。結(jié)果表明，aP-100--1序列可能是負調(diào)控序列，這也可能導(dǎo)致AiiA蛋白表達量低。

圖3 亞克隆片段啟動E.coli綠色熒光蛋白GFP的表達

圖4 側(cè)翼序列功能鑒定菌株熒光強度值

圖5 突變片段啟動E.coli綠色熒光蛋白GFP的表達

定點突變是研究基因和啟動子功能的有效方法［16-18］，前期研究顯示，定點突變能夠有效的用于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究［19］。aiiA定點突變后，表達的AiiA蛋白其酶活力和溫度耐受性均得到了提高［20］。本研究以定點突變技術(shù)來研究aiiA啟動子活性位點，結(jié)果表明單點突變使得該基因啟動子的活性顯著降低，雙點突變（P-295--101（-144、-147Mu））和TATA盒缺失進一步降低其活性。

圖6 突變菌株熒光強度值

啟動子具有啟動和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用［21-123］。傳統(tǒng)原核啟動子一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-10區(qū)（TATAAT）和-35區(qū)（TTGACA），然而本研究發(fā)現(xiàn)，位于aiiA轉(zhuǎn)錄起始位點上游-100 bp處的序列沒有啟動子活性（-295--101 bp可能是aiiA的啟動子）。有研究表明，蘇云金芽胞桿菌的cryIIIA毒素基因的啟動子區(qū)域至少由基因上游的-635--553 bp，-553--367 bp以及-367-18 bp 3個結(jié)構(gòu)域組成［24］?？赡芴K云金芽胞桿菌基因的啟動子存在距轉(zhuǎn)錄起始位點較遠的機制。蘇云金芽胞桿菌AiiA蛋白表達較低很可能是由aiiA啟動子上游和下游序列對aiiA啟動子的負調(diào)控作用所致。

當(dāng)然本文使用大腸桿菌替代原始宿主蘇云金芽胞桿菌進行研究也存在一些不足，首先不同的表達載體其轉(zhuǎn)錄因子可能不同，會對轉(zhuǎn)錄調(diào)控造成不同的影響；其次，用gfp代替aiiA，可能會由于目的蛋白不同而導(dǎo)致其表達模式的不同，從而影響對啟動子功能的判斷。盡管如此，本研究根據(jù)破囊壺菌Δ4-脂肪酸脫飽和酶基因5'端側(cè)翼區(qū)域的研究方法對蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'端側(cè)翼序列克隆并在大腸桿菌中進行分段表達，其確實可以啟動報告基因gfp的表達，具有啟動子功能活性，為aiiA基因最可能的啟動子區(qū)域及其重要的轉(zhuǎn)錄元件［25］；但其啟動aiiA表達的具體調(diào)控機制仍需要進行同源性表達分析驗證。該結(jié)果有利于后續(xù)進一步深入研究該啟動子在原始宿主中的功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機制，也有利于對aiiA在大腸桿菌等異源宿主中進行高表達的研究。

4 結(jié)論

蘇云金芽胞桿菌aiiA的5'端-295--1 bp為aiiA的啟動子區(qū)，-429--296與-100--1序列是aiiA的負調(diào)控序列。-150--142 bp區(qū)域的2個TATA盒對aiiA的5'端側(cè)翼區(qū)域的啟動子活性起重要作用。