李天真 周威 殷華 張同存 劉濤

（1. 天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

苦碟子又名苦荬菜，學(xué)名抱莖苦荬菜（Ixeris sonchifoliaHance），為菊科苦荬菜屬草本植物，主要分布于我國(guó)北部、東部地區(qū)?？嗟痈稍锶菘扇胨?，味苦、辛、性寒，具有清熱解毒、活血化瘀及排膿止痛之功效［1］?？嗟幼⑸湟菏且钥嗟訛樵咸崛【贫傻撵o脈注射液，具有多種藥理功效，如抗血小板聚集，抑制血栓形成，降低血管阻力等作用。苦碟子注射液的化學(xué)成分復(fù)雜，含有酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、核苷類(lèi)和倍半萜內(nèi)酯類(lèi)等多種化合物［2-4］，其中酚酸類(lèi)化合物有綠原酸和二咖啡?？崴岬龋?-7］。由于酚酸類(lèi)化合物具有酚羥基或苯烯結(jié)構(gòu)，具有廣泛的生理活性（如抗氧化［8］、抗紫外線［9］、抗腫瘤作用［10］、抑菌［11］等），在食品、醫(yī)藥、化妝品原料方面有著廣泛的用途［12-13］。因此，植物體內(nèi)的酚酸類(lèi)化合物生物合成受到廣泛的研究。

綠原酸（Chlorogenic acid），化學(xué)名3-O-咖啡酰奎尼酸（3-O-caffeoylquinic acid），是一種新型的抗氧化劑，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛用途。目前已報(bào)道植物中綠原酸生物合成途徑存在3種：（1）香豆酰輔酶A作為?；w，在對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HQT或者HCT）的催化作用下與奎尼酸縮合生成香豆?？崴?，進(jìn)而在香豆酸-3-羥化酶作用下生成綠原酸；（2）?；w為咖啡酰葡萄糖苷，其經(jīng)絲氨酸羧肽酶（SCPL）的作用下與奎尼酸縮合生成綠原酸；（3）對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）催化莽草酸與香豆酰輔酶A合成香豆酰莽草酸，進(jìn)而在香豆酸-3-羥化酶作用下生成咖啡酰莽草酸。對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）催化咖啡酰輔酶A與奎尼酸合成綠原酸。在途徑1和3中，對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）是綠原酸生物合成的關(guān)鍵酶，屬于BAHD?；D(zhuǎn)移酶家族，該酶類(lèi)的氨基酸序列具有兩個(gè)高度保守的催化活性區(qū)域“HXXXDG”和“DFGWG”。目前在多種植物中都有HCT?；D(zhuǎn)移酶的報(bào)道，如Lellemand等［14］從中果咖啡（Coffea canephora）中擴(kuò)增得到HCT基因；Legrand等［15］從菊苣（Cichorium intybus）中獲得兩條HCT酰基轉(zhuǎn)移酶，并證明具有在植物體中催化綠原酸合成的活性。此外，在金銀花［16］、朝鮮薊［17］等多種植物中也有HCT?；D(zhuǎn)移酶的報(bào)道。

目前，苦碟子中HCT酰基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。為研究苦碟子中酚酸類(lèi)化合物的生物合成及關(guān)鍵基因功能鑒定，本研究對(duì)苦碟子葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析以及RT-PCR技術(shù)，得到一條HCT全長(zhǎng)基因。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)其氨基酸特點(diǎn)進(jìn)行分析。在大腸桿菌中對(duì)該基因與對(duì)香豆酰輔酶A連接酶（At4CL）進(jìn)行共表達(dá)，并通過(guò)飼喂前體物咖啡酸和奎尼酸實(shí)現(xiàn)了綠原酸的合成，證明該酶為HCT?；D(zhuǎn)移酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株大腸桿菌transT1用于質(zhì)粒的擴(kuò)增及基因克隆，大腸桿菌BL21（DE3）用于蛋白的過(guò)表達(dá)及綠原酸的合成。質(zhì)粒pET28a與質(zhì)粒pCDFDuet購(gòu)于Novagen公司。

1.1.2 植物材料 本實(shí)驗(yàn)所用苦碟子為溫室培育3個(gè)月的幼苗，選取3個(gè)月以上的葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，置于液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩？嗟愚D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及總 RNA 的抽提是由華大公司完成。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基 KOD-plus-New高保真DNA聚合酶購(gòu)自東洋坊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ購(gòu)自Fermentas公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech公司；T4連接酶購(gòu)自TaKaRa Biotechnology公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；咖啡酸、奎尼酸購(gòu)自天津希恩思化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，用于質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、種子液的準(zhǔn)備；M9Y培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g/L，磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，NaCl 0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂2 mmol/L，氯化鈣0.1 mmol/L。適量的抗生素：鏈霉素 200 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的合成及基因PCR擴(kuò)增 以1 μg苦碟子總RNA為模板，以O(shè)ligo（dT）18為引物，按TransScript反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)所述反應(yīng)條件，合成單鏈cDNA。取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在50 μL體系中進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。IsHCT的引物為IsHCT-5FNcoⅠ：CATGCCATGGGAAGTGATCAGAAGATG ATGATG（下劃線為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）；IsHCT-3RHind Ⅲ：CCCAAGCTTTTACAATTCATACAAAAA CTTCTC（下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)）。PCR條件為：94℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，58℃復(fù)性30 s，68℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，凝膠電泳回收目的片段。

At4CL（GenBank：KX817185.1）來(lái)自植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），以擬南芥全長(zhǎng)cDNA為模板，PCR引物為At4CL-5F-NcoⅠ：AAAACCATGGCGCCACAAGAACAAGCAG（ 下 劃 線為NcoⅠ 酶 切 位 點(diǎn) ）At4CL-3R-BamH I：AAAAGGATCCTCACAATCC-ATTTGCTAG（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），PCR條件同上，凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 載體構(gòu)建 pET28a質(zhì)粒和IsHCT分別用NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，載體和基因片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4 DNA連接酶對(duì)載體和片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌transT1，獲得重組載體pET28a-IsHCT。pCDFDuet質(zhì)粒和At4CL分別用NcoⅠ和BamH I雙酶切，載體和基因片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4 DNA連接酶對(duì)載體和片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌transT1，獲得重組載體pCDFDuet-At4CL。

1.2.3 重組菌構(gòu)建 將載體pET28a-IsHCT和pET28a分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/IsHCT和 BL21（DE3）/W 用 于 蛋白表達(dá)。將載體pET28a-IsHCT與載體pCDFDuet-At4CL共同轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/IsHCT-At4CL。再將載體pET28a和pCDFDuet共同轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/WW，作為對(duì)照菌株，用于發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別挑取重組菌BL21（DE3）/W和BL21（DE3）/IsHCT的單克隆于5 mL液體LB中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；按體積比為1∶50轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)6-8 h后，收集菌液2 mL，12 000 r/min離心10 min；加入1 mL的50 mmol/L Tris HCL緩沖液（pH 7.4）重懸菌體，取40 μL重懸液于1.5 mL離心管中，加入10 μL的5×loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心 10 min，上樣量 5 μL。

1.2.5 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取重組菌BL21（DE3）/IsHCT-At4CL和BL21（DE3）/MM菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；按體積比為1∶50轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于16℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)12 h，收集菌體于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，更換M9Y培養(yǎng)基，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加2 mmol/L的咖啡酸和2 mmol/L的奎尼酸，30℃培養(yǎng)24 h，取上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.6 綠原酸的HPLC和LC-MS分析鑒定 取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測(cè)系統(tǒng)是島津液相色譜儀；檢測(cè)條件為：HPLC流動(dòng)相A = 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-25 min 80% A和20% B；25-30 min 100% B；31-40 min 80% A 和20% B。進(jìn)樣量20 μL；液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm。

LC-MS檢測(cè)：配有紫外檢測(cè)器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質(zhì)譜儀。檢測(cè)條件包括：Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm；流動(dòng)相A= 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-25 min 80%A 和 20% B；25-30 min 100% B；31-40 min 80% A和20% B。進(jìn)樣量20 μL；ESI正離子源，分子量掃描范圍50-800。

圖1 IsHCT基因擴(kuò)增片段凝膠電泳

2 結(jié)果

2.1 IsHCT基因的克隆

通過(guò)苦碟子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)一條HCT基因序列，該基因具有完整編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為1 320 bp，根據(jù)該ORF的序列設(shè)計(jì)基因的擴(kuò)增引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了完整基因（圖1），命名為IsHCT基因（GenBank：MH151086）。

圖2 IsHCT氨基酸序列分析

2.2 IsHCT蛋白序列分析

IsHCT與已報(bào)道的對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶，包括來(lái)源菊苣（Cichorium intybus）中的 CiHCT（ANN12610.1）、金銀花（Lonicera japonica）中的 LjHCT（AFS68800.1）、桔 梗（Platycodon grandiflorus） 中 的 PgHCT（AEM63676.1）、刺苞菜薊（Cynara cardunculus var.Scolymus） 中 的 CsHQT（ACJ23164.1） 和 煙 草 中（Nicotiana tabacum L.）的 NtHCT（XP_016484287.1），進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該酶含有BAHD?；D(zhuǎn)移酶保守序列 HXXXDG 和 DFGWG（圖2）。

2.3 IsHCT蛋白序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)IsHCT氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果（圖3）顯示，IsHCT的氨基酸序列與菊苣中的 CiHCT（ANN12611.1）的序列同源性高達(dá)95%。通過(guò) MEGA5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)IsHCT與菊苣的CiHCT遺傳距離最近，二者聚為一小支。

圖3 IsHCT基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 載體pET28-IsHCT的構(gòu)建和驗(yàn)證

將擴(kuò)增的IsHCT分別用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，同時(shí)對(duì)載體pET28用相同的酶酶切，將IsHCT片段插入到載體pET28a中得到重組載體pET28a-IsHCT（圖4-B）。對(duì)重組載體用NcoⅠ，Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證，pET28a-IsHCT得到大小為1.3 kb和5.3 kb的兩條帶（圖4-A），與理論條帶大小一致，并送金唯智公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2.5 蛋白IsHCT SDS-PAGE分析

菌株BL21（DE3）/W和BL21（DE3）/IsHCT按照1.2.4的方法進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)對(duì)其全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，蛋白大小為48.27 kD（圖 5）。

2.6 大腸桿菌發(fā)酵菌株的構(gòu)建

將載體pET28a-IsHCT與pCDF-At4CL共轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 BL21（DE3）中，得到重組菌株BL21（DE3）/IsHCT-At4CL。并將載體 pET28a和pCDFDuet 轉(zhuǎn)入BL21（DE3）作為上述菌株的對(duì)照菌株BL21（DE3）/WW。對(duì)重組菌進(jìn)行兩步法發(fā)酵，并在第二步轉(zhuǎn)換M9Y培養(yǎng)基時(shí)向培養(yǎng)基中添加咖啡酸和奎尼酸。本研究中所構(gòu)建的綠原酸在大腸桿菌中的合成途徑如圖6所示。

圖4 載體pET28a-IsHCT的構(gòu)建

圖5 BL21（DE3）/W與BL21（DE3）/IsHCT的SDSPAGE檢測(cè)圖

2.7 綠原酸HPLC檢測(cè)及LC-MS鑒定

取24 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，在16 min處有新化合物的產(chǎn)生，與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間（Rt）一致（圖7-A）。綠原酸的分子量為354，LC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示16 min峰的［M+H］+= 355，確定該峰對(duì)應(yīng)的化合物為綠原酸（圖7-B）。

圖6 綠原酸的合成途徑

3 討論

苦碟子中含有多種酚酸類(lèi)化合物，如綠原酸、單咖啡酰酒石酸、菊苣酸等，但是這些化合物在苦碟子中的分子機(jī)制尚有待深入研究。本研究在對(duì)苦碟子轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，篩選出一條HCT基因。該基因序列長(zhǎng)1 320 bp，編碼439個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析得出其與菊苣CiHCT同源性高達(dá)95%，其次與CsHQT同源性也很高，且IsHCT與CiHCT、CsHQT聚為一大分支。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CiHCT參與了菊苣植物體內(nèi)的綠原酸的合成［15］，推測(cè)出IsHCT很有可能是參與了苦碟子中綠原酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)合成的重要功能基因。

HCT作為植物體苯丙素類(lèi)化合物合成途徑的關(guān)鍵酶，在植物體次生代謝物（酚酸類(lèi)化合物、木質(zhì)素、黃酮類(lèi)物質(zhì)等）合成過(guò)程及代謝物量的平衡中起著重要作用［18］。有研究表明，降低植物中HCT基因的表達(dá)量，對(duì)香豆酰輔酶A則更多的被查爾酮合酶催化生成黃酮類(lèi)物質(zhì)［19］。此外，HCT不僅可以催化咖啡酰輔酶A與奎尼酸合成綠原酸，還可以逆向催化綠原酸生成咖啡酰輔酶A與奎尼酸，從而促使更多底物用于木質(zhì)素的合成［20］。本研究獲得了苦碟子中的IsHCT序列，通過(guò)體內(nèi)酶實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了IsHCT具有香豆酰轉(zhuǎn)移酶功能，能催化綠原酸的合成，為苦碟子中綠原酸的合成研究及其在苦碟子中次級(jí)代謝物間的調(diào)控機(jī)制研究奠定重要的基礎(chǔ)。后續(xù)研究可以通過(guò)調(diào)控IsHCT基因的表達(dá)等進(jìn)而調(diào)控苦碟子中綠原酸的含量，對(duì)提高苦碟子藥材的品質(zhì)具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究從苦碟子中擴(kuò)增出IsHCT基因，有酰基轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)域HXXXDG和DFGWG，與菊苣中CiHCT基因相似性高達(dá)95%。通過(guò)IsHCT基因在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)及前體飼喂實(shí)現(xiàn)了綠原酸的合成，明確了IsHCT基因具有對(duì)香豆酰轉(zhuǎn)移酶功能。