徐海冬 冷奇穎 PATRICIA Adu-Asiamah 王章 李婷 張麗

（廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088）

環(huán) 狀 RNA（circular RNA，circRNA） 是 一 類新發(fā)現(xiàn)的內源性非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA）相比，circRNA不存在5'和3'端，為共價鍵連接在的環(huán)狀閉鎖結構，對RNA外切酶（RNase R）具有抗性，表達穩(wěn)定，不易降解。近幾年研究發(fā)現(xiàn)circRNA與人類疾病發(fā)生關聯(lián)緊密，成為RNA領域研究的新熱點。早期研究認為circRNA是標準RNA剪接的副產(chǎn)物，但隨著研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在真核生物中普遍存在，認為可能具有一定的生物學功能。circRNA來自RNA前體（pre-RNA）的反式剪接，即下游外顯子同上游外顯子反向結合形成地環(huán)形結構。不同序列來源的circRNA可發(fā)揮不同的生物學功能。有報導發(fā)現(xiàn)circRNA可吸附miRNA發(fā)揮miRNA海綿（miRNA sponges）作用，也有報導發(fā)現(xiàn)RNA環(huán)化與mRNA形成可競爭剪接因子，以此調控目的基因的表達。但是，circRNA的主要作用還未清晰。本文總結了circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程、特征及分類、環(huán)化生成及調控機制、主要功能及在畜禽中的研究進展，并對其在畜禽中的研究進展進行了展望，以期為進一步研究circRNA提供一定的理論依據(jù)和技術指導。

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程

circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)具有環(huán)形結構的內源性RNA分子，廣泛存在于真核生物體內［1］。如表1，circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程有3個階段：（1）circRNA真實存在性；（2）真核生物中circRNA的普遍性；（3）某個circRNA的功能性研究。

表1 circRNA發(fā)現(xiàn)歷程簡況表

1976年，Sanger和 Kolakofsky［2-3］在植物類病毒和副流感病毒顆粒中首次發(fā)現(xiàn)了circRNA。1979年，Capel等［14］在動物細胞和真菌酵母中發(fā)現(xiàn)circRNA，之后也在其他真核細胞中發(fā)現(xiàn)了circRNA，如在小 鼠SRY［14］，大鼠細胞色素P4502C24［5］、人的P4502C18中［6］等。但由于circRNA結構的特殊性及當時有限的研究手段，認為circRNA異常拼接產(chǎn)物。近年來高通量測序技術和生物信息學分析技術迅速發(fā)展為circRNA的研究提供了契機。2012年，Danan等［7］在古細菌發(fā)現(xiàn)circRNA的普遍存在性，并認為其可能具有生物學功能。Salzman等［8］通過RNA-Seq方法在人體中首次鑒定出約80個circRNA，至此circRNA的研究才正式進入人們的視野。

Jeck等［9］在人類的成纖維細胞中檢測出超過25 000個circRNA，Memczak等［15］利用高通量測序結合人類白細胞數(shù)據(jù)庫鑒定出1 950種人類circRNAs，1 903種小鼠circRNAs和724種線蟲circRNAs，其中人和小鼠中共有81種circRNAs高度保守。隨著大量研究表明，circRNA廣泛存在真核生物等高等動物體內，并且在基因表達和機體生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。例如，circFUT10可抑制牛成肌細胞增殖，促進分化［11］；circEIF3J和circPAIP2能促進母基因的線性轉錄本的表達［12，16］；circZNF609具有編碼起始密碼子和終止密碼子的開放閱讀框［17］；circCDR1as和circSry可與AGO蛋白形成沉默復合體抑制翻譯起始［10，18］。目前circRNA被認為是一類新的功能大分子，參與基因表達調控，豐富了真核生物轉錄調控的多樣性和復雜性［9，18］。circRNA的發(fā)現(xiàn)為研究細胞發(fā)育和基因轉錄調控的分子機制掀開新的一頁，對生命活動的探索具有重要意義。

2 circRNA的特征及分類

2.1 circRNA的特點

目前發(fā)現(xiàn)，circRNA廣泛存在于不同生物體內的各種類型的細胞和組織中。與線性RNA相比，circRNA是沒有游離的5'帽子和3'Poly（A）尾巴的閉合環(huán)狀結構。由于其閉鎖的環(huán)狀結構，circRNA對RNA外切酶RNaseR不敏感［19］，比線性RNA更穩(wěn)定，不易被降解，大多數(shù)circRNA的半衰期超過48 h，而線性 RNA 的平均半衰期只有約 10 h［9，20］，這可能是circRNA可以抵抗分支酶和核酸外切酶RNase R的降解。但大部分circRNA在血清外泌體中并不穩(wěn)定，半衰期小于15 s［21］，且容易受其他RNA的干擾。癌細胞和癌組織中circRNA較線性轉錄本低［22］，可能是線性轉錄本在細胞中易達到合成與降解的平衡，而circRNA更加穩(wěn)定，在正常增殖的細胞中不斷被“積累”，在癌細胞無限增殖過程中被“稀釋”。circRNA的長度波動較大，但在大多數(shù)真核生物中circRNA具有高度的序列保守性［18，23］。全基因組分析發(fā)現(xiàn)來源編碼區(qū)外顯子的circRNA具有高度的序列保守性，但是基因間和內含子來源的circRNA保守性相對較低［18］。

利用一種新的檢測工具CIRI explorer2發(fā)現(xiàn)了同一基因中一些不保守的外顯子只在circRNA中出現(xiàn)，而不存在于線性RNA中。這種只出現(xiàn)在circRNA中的外顯子，是因為多個轉錄本在形成成熟線性RNA時，由于線性RNA的不穩(wěn)定性而被降解掉，還是因為在形成circRNA時由選擇性剪接而特意產(chǎn)生，到目前為止還不清楚。

研究報道發(fā)現(xiàn)circRNA在各種生物中表達豐富，其表達水平多數(shù)高于母基因的線性轉錄本［9，15］。而且circRNA表達常具有一定的組織、時序和疾病特異性［15，18］。已知大多數(shù)的 circRNA 屬于非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）， 但 是 少 數(shù)circRNA含有內部核糖體進入序列（Internal ribosome entry site，IRES）可能具有編碼能力［24-25］。

2.2 circRNA的分類

circRNA來源于母基因的外顯子、內含子、非編碼區(qū)、反義鏈轉錄本或基因間區(qū)。根據(jù)circRNA序列來源可以分為4大類（表2）［16］：第一類是全部來源外顯子的circRNA（Exonic circular RNA，EciRNA）；第二類是全部來源于內含子的circRNA（Intronic circular RNA，ciRNA）第三類是來源于外顯子和內含子的circRNA（Exon-intron circular RNA，EIciRNA）；第四類包括來源于反義鏈轉錄本的反義circRNA（Antisense circular RNA）、來源于基因間序列或其他未注釋基因組序列的circRNA（Intergenic circular RNA）。絕大多數(shù)circRNA屬于EciRNA，其序列來源于外顯子特別是編碼區(qū)序列。

表2 circRNA 的分類［12，16］

4大類circRNA除了序列來源不同外，還具有以下區(qū)別：（1）EciRNA和EIciRNA整個分子均是由3'-5'磷酸二酯鍵組成，但是ciRNA接合位點（junction）處由 2'-5'磷酸二酯鍵連接［26］；（2）EciRNA側翼內含子的長度通常大于內含子的平均長度，并通常含有反向重復序列［9，27］；（3）ciRNA通常包含靠近5'剪接位點的7 nt GU富集堿基序列和靠近分支位點（Branchpoint，BP）的11 nt C富集堿基序列［28］；（4）EciRNA主要存在于細胞質中［8，23］，而 EIciRNA 和 ciRNA 主要存在于細胞核中［26，29］；（5）EciRNA 的序列保守性高于 ciRNA 和基因間circRNA的序列保守性［16］。

3 circRNA的生成和調控機制

真核生物RNA是遺傳信息從DNA到蛋白質傳遞的中間媒介，遺傳信息在RNA水平上有著廣泛且復雜的調控方式，基因在轉錄后的pre-RNA要經(jīng)過復雜的加工才能形成成熟的RNA。單個基因位點可以通過經(jīng)典可變反向剪接（Alternative backsplicing junctions）及經(jīng)典可變剪接（Alternative splice junctions）產(chǎn)生多種類型的circRNA［30］，因此不同來源的circRNA的生成機制也不同。

3.1 EciRNA的生成機制

EciRNA是初級轉錄產(chǎn)物經(jīng)過特殊的反向剪接反應（Back-splicing）形成的，是下游外顯子序列5'剪接位點（5' splice site，5'SS）與上游外顯子3'剪接位點（3'splice site，3'SS）反向連接生成了circRNA（圖1）。目前有兩種模型解釋了EciRNA反向剪接形成機制：（1）依賴于剪接體的套索驅動環(huán)化模型（外顯子跳躍）（Lariat-driven circularization）（圖 1-B）；（2）內含子配對驅動環(huán)化模型（Intron-pairing-driven circularization）（圖 1-C）。

套索驅動環(huán)化是由pre-mRNA在剪接過程中部分RNA發(fā)生折疊，拉近了非相鄰外顯子距離，發(fā)生外顯子跳躍（Exon skipping）的經(jīng)典剪接（圖1-B）。被跳過外顯子的上游剪接受體（Splice acceptor，SA）和下游剪接供體（Splice donor，SD）共價結合形成包含外顯子的套索前體（Exon-containing lariat precursor），該前體通過內部剪接去除內含子，形成EciRNA［31］。某些個circRNA中存在線性mRNA缺失的外顯子，保護了這些外顯子不被降解掉，這說明外顯子跳躍是形成circRNA的合理機制［8-9］。許多EciRNA側翼連接點有規(guī)范的剪接信號［9-10］，經(jīng)典的剪接位點決定了外顯子環(huán)化效率［32］，抑制經(jīng)典剪接體會導致circRNA水平降低［32］，這些都表明經(jīng)典的剪接體機制是circRNA生成所必需的。酵母中大多數(shù)的circRNA都是由外顯子套索前體產(chǎn)生［33］。

內含子驅動環(huán)化是位于側翼內含子區(qū)域反向互補序列（Flanking intronic regions reverse complementary sequences，RCSs）（如Alu原件等）（圖1-C）互補配對，這會誘導下游外顯子序列的5'SS反向接近上游外顯子3’SS，有效地促進了反向剪接的發(fā)生［9］，隨后剪接體切除剩余內含子形成環(huán)形RNA分子［34］。當內含子沒有被完全剪切掉，保留在新生成環(huán)狀外顯子之間，就會形成EIciRNA類型的分子。

“套索驅動”和“內含子配對驅動”的主要區(qū)別是先發(fā)生經(jīng)典剪接還是反向剪接［35］?！疤姿黩寗印笔窍劝l(fā)生經(jīng)典剪接，產(chǎn)生一個線性RNA和一個包含外顯子的內含子套索，隨后內含子套索通過反向剪接生成circRNA［36］?！皟群优鋵︱寗印笔窍劝l(fā)生反向剪接，并直接生成circRNA［9］。哺乳動物中大多數(shù)EciRNA是由內含子配對驅動生成的，而低級的真核生物中的EciRNA則是大多由套索驅動生成［33］。

3.2 EciRNA環(huán)化調控機制

有研究發(fā)現(xiàn)外顯子環(huán)化與線性剪接競爭剪接因子，進而與線性RNA存在競爭關系，circRNA的環(huán)化效率也受到剪接因子的調節(jié)［16］，如一些順式元件（cis-acting splicing regulatory elements）和反式原件（trans-acting splicing elements）（圖 1）［16］。

研究發(fā)現(xiàn)單個外顯子的circRNA（single exon circular RNA）長度通常大于多個外顯子的circRNA（Multiple exon circular RNA）的平均長度［8］。Eci-RNA側翼內含子含有倒置重復序列（如Alu等）（圖1-C）［16］，并且通常含有多個重復序列［8］。這些序列存在競爭性配對，調節(jié)環(huán)化效率并造成可變環(huán)化，致使同一個母基因可以形成由不同外顯子和內含子組成的多樣型circRNA［27-28］。有研究發(fā)現(xiàn)只有30-40 nt短側翼反向重復序列就足以促進環(huán)化［8］，但這種側翼區(qū)反向互補重復序列不一定有效誘導外顯子環(huán)化，大多數(shù)的circRNA由短散在核重復序列（Short interspersed nuclear elements，SINEs）驅動形成，這說明內含子配對的穩(wěn)定性是circRNA生成的必要條件［37］。

RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）可以通過與內含子中一些短的順式元件結合發(fā)揮作用（圖1-D），促使下游外顯子序列的5'SS反向接近上游外顯子的3'SS，形成有利于反向剪接的結構，促進外顯子環(huán)化［16］。在人和果蠅體內發(fā)現(xiàn)剪接因子盲肌蛋白（Muscleblind，MBL/MBNL1）可以結合到來源于第二外顯子circMbl的pre-RNA內含子的MBL結合位點，使兩個內含子靠近，從而促進circMbl生成［38］。震動蛋白（Quaking，QKI）能特異識別NA-CUAAY核心（core）及UAAY半位點（half-site）［39］，牽拉結合點相互縮小空間距離，在人類上皮細胞-間質細胞轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的過程中誘導 EciRNA 生成［16］。脂肪瘤融合蛋白（Fused in sarcoma/Translocated in liposarcoma，F(xiàn)US/TLS）可結合到內含子側翼區(qū)，調控circRNA的形成［40］。有報道稱提高RNA聚合酶II轉錄延伸率（RNA-Pol II transcription elongation rate）可以增加初始circRNA的表達水平［41］。

圖1 circRNA的生成示意圖［16］

有報道發(fā)現(xiàn)RNA編輯酶腺苷脫氫酶（Adenosine deaminase，ADAR）可以結合RNA雙鏈，通過將腺苷酸轉變成肌苷酸（A變成I）（圖1-E）。環(huán)化外顯子側翼區(qū)重復序列的雙鏈產(chǎn)生U：I錯配，使RNA雙鏈結合能力減弱［34］。ADAR高表達會損傷mRNA前體環(huán)狀配對序列，減少circRNA的生成［16］。在人和線蟲中發(fā)現(xiàn)，ADAR的缺失造成circRNA的表達水平異常上升［34］。

EciRNA的生成是多個順反調控原件共同調節(jié)的結果。例如，Laccase基因的環(huán)化受到內含子重復序列和RNA結合蛋白的調控［42］，ADAR也會減弱RNA的內含子配對，控制circRNA的生成。

3.3 ciRNA的生成機制

ciRNA是由含有特殊序列內含子在剪接過程中逃避脫支酶（Debranching enzyme，DBE）消化形成的circRNA［12］。這類內含子在3'SS端的分支位點（BP）附近含有11 nt C富集序列，在5'SS附近含有7 nt GU富集序列（圖2），這些序列形成的特殊結構會阻止脫支酶與之結合［16，28］。

剪接過程中兩個原件結合先形成包含外顯子和內含子的套鎖中間體（Lariat），再在脫支酶和核酸酶作用下形成ciRNA。其過程包括兩次轉酯反應（圖2）：首先分支位點（Branchpoint，BP）的2'-OH攻擊外顯子5'SS，形成內含子套索結構，而后5'外顯子的3'-OH攻擊下游外顯子3'SS，釋放線性內含子并將外顯子順序連接，最后線性內含子釋放3'尾巴后形成2'-5'連接的內含子來源的circRNA。正常內含子套索則是在脫支酶作用下被解開，再被核酸外切酶消化，而含有11 nt C和7 nt GU特殊序列的內含子套索會限制脫支酶與之結合，殘余的部分線性RNA序列會被核酸外切酶降解［12］。不同于EciRNA，ciRNA對RNA脫支酶不敏感，并含有2'-5'接合點（Junction）［26］。ciRNA和 EIciRNA 主要存在于細胞核中調控基因表達［16］。

也有研究發(fā)現(xiàn)前體tRNA能剪切成環(huán)形成tricRNA（tRNA intronic circRNA）［43］，tRNA 剪接內切酶復合體通過識別前體tRNA內特殊的膨脹-螺旋-膨脹（BHB）的結構序列，切除反密碼子環(huán)中的內含子［38］，此部分內含子兩端相連接形成tricRNAs［44］。有研究報道，在白血病患者中的PML/RARα基因上發(fā)現(xiàn)，了2個因染色體異位融合的 circRNA（fusion circRNA，f-circRNA）［45］。因此，circRNA的生源機制有待進一步探索明確。

4 circRNA的功能

circRNA廣泛存在于各個物種中，大多數(shù)真核生物的circRNA具有序列保守性，表達呈現(xiàn)一定的組織特異性和發(fā)育階段性，這表明circRNA是一種功能分子。有報道發(fā)現(xiàn)circRNA具有調控基因轉錄、調控蛋白質翻譯、吸附miRNA等功能，也有報道發(fā)現(xiàn)一些circRNA具有編碼多肽的能力（圖3）。

圖2 ciRNA的生成機制［12］

4.1 circRNA可調控基因轉錄

圖3 circRNA功能示意圖［46］

CircRNA可與轉錄因子結合調控基因轉錄（圖3-B）。EciRNA可以與細胞內某些蛋白質分子特異性結合，作為腳手架（Scaffold）與RNA或DNA結合，為RBP、RNA、DNA之間互作提供平臺。這些轉錄因子包括 RNA 聚合酶 II、Quaking（QKI）［16］、EIF4A3［47］和 MBL［38］等。例如，circMbl上含有MBL 結合位點［32］，而 MBL 會促進circMbl和MblmRNA的生成。因此circMbl作為自我調節(jié)分子會減少circMbl和MblmRNA的合成［48］，提高果蠅和人細胞內線性剪接水平，會使circRNA的生成量明顯減少［49-50］。細胞核中位于轉錄位點附近的內含子錨蛋白重復結構域52（ci-ankyrin repeat domain 52，ci-ankrd 52）和內含子沉默信息調節(jié)因子7（Silent information regulator 7，ci-sirt 7）［26］， 可 聯(lián) 合 RNA聚合酶II復合體，順式調節(jié)母基因的線性轉錄本表達。circEIF3J和circPAIP2會與U1小核核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）相互作用于基因轉錄起始位點上游300 bp處，順式方式調控母基因線性轉錄本的轉錄［12，16］。circRNA還可以通過與線性轉錄本競爭剪接的方式調控母基因的表達。線性剪接與反向剪接的競爭決定了circRNA和母基因線性轉錄本的表達水平。來源于小鼠甲酸精基因（Formin，F(xiàn)mn）的circFmn包含了轉錄起始位點，遺留了一個非編碼的線性轉錄物，因此circFmn可作為mRNA陷阱（mRNA trap）隔離轉錄起始位點，降低Fmn蛋白的表達水平［51］。

4.2 circRNA與蛋白質相互作用

也有報導circRNA與RBP結合能發(fā)揮生物學功能（圖3-D）。circCDR1as和circSry可與miRNA的效應因子AGO相結合，形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）［10，18］，占據(jù)了mRNA的翻譯起始位點，抑制翻譯起始。CircANRIL可與pre-rRNA競爭性結合PES1蛋白，抑制核酸外切酶對結合PES1蛋白后的pre-rRNAs加工過程［52］，表明circANRIL影響核糖體成熟，阻礙蛋白質翻譯，進而導致細胞凋亡。circFOXO3與細胞周期依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CD-K2）、P21形 成circFOXO3-CDK2-P21三 元 復合物抑制細胞周期［53］。CDK2與細胞周期蛋白E（Cyclin E）結合形成cyclin E-CDK2復合物，促進細胞G1期向S期過度；CDK2也可與細胞周期蛋白A（Cyclin A）結合形成cyclin A-CDK2復合物，促使細胞完成S期。P21結合CDK2可抑制CDK2與cyclin A、cyclin E的結合，circFOXO3-CDK2-P21三元復合物增強了P21對CDK2的抑制作用，避免了cyclin E-CDK2復合物的形成，阻斷細胞從G1期進入S期，同時也避免了cyclin A-CDK2復合物的形成，使細胞停滯在S期或發(fā)生凋亡。circFOXO3在細胞質中還可以與抗衰老相關蛋白分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、E2F1 轉錄因子（E2F transcription factor 1，E2F1）以及抗應激黏著斑激酶（Facal adhesion-associated protein kinase，F(xiàn)AK）、HIF1α結合，阻礙這些蛋白進入細胞核或線粒體，從而促進心肌細胞衰老［54］。

4.3 circRNA作為miRNA海綿

MicroRNA（miRNA） 是 一 種 大 約 22 nt的ncRNA分子，通過與目的基因mRNA的3’UTR結合降低目的基因的表達水平。circRNA含有大量的miRNA應答原件（miRNA response elements，MREs），可吸附miRNA（圖3-A），發(fā)揮miRNA海綿功能，降低miRNA對其靶基因的抑制作用。由此可見circRNA可作為競爭性內源RNA（Competing endogenous，ceRNA）在轉錄后水平調控靶基因的表達［16］。例如，來源于小腦退行性相關蛋白1反義轉錄本（Cerebellar degeneration-related 1 antisense transcript，CDR1as）的circRNA 具有 70個 miR-7結合位點，可調控胰島素受體底物1（Insulin receptor substrate-1，IRS-1）等多個靶基因的表達［18］。有研究表明miR-671與CDR1as結合后會使得CDR1as裂解，并可釋放與之結合的miR-7［55］。阿格蛋白（Argonature，AGO）可與CDR1as結合，使CDR1as免于降解及結合miR-7。circHIPK3可結合miR-124-3p和miR-338-3p調控β細胞Slc2a2、Akt1、Mtpn等關鍵基因表達［56］。來源于Y染色體性別決定基因（Sex-determining region Y，SRY）的circSry具有16個miR-138結合位點，可吸附miR-138調節(jié)腫瘤的侵襲、發(fā)展和轉移［55，57］。circFUT10可以結合 miR-133a進而抑制牛成肌細胞增值、促進分化［11］；circMTO1可以吸附miR-9抑制人肝癌細胞增值性和侵染性［58］；circZFR可吸附miR-130a和miR-107抑制人胃癌細胞增殖和促進凋亡［59］；circRBFOX2s可吸附miR-206促進雞成肌細胞增殖［60-61］。對比lncRNA等線性miRNA海綿分子，circRNA不易被RNA外切酶降解，具有較高的穩(wěn)定性和時效性［16，58］。一些研究表明哺乳動物中的circRNA很少包含大于10個以上的miRNA結合位點，這可能與circRNA本身的穩(wěn)定性有關［36］

4.4 circRNA可翻譯功能蛋白質

有些circRNA含有可編碼多肽。目前報道的circRNA翻譯機制有兩種：（1）依賴內部核糖體嵌入位點（Internal ribosomal entry site，IRES）（圖3-C）；（2）依賴 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修飾。人circSHPRH可利用重疊密碼子翻譯功能蛋白質抑制膠質瘤生成［13］。丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus，HDV）核心的負鏈circRNA可編碼122個氨基酸的HDV抗原（Hepatitis D virus antigen，HDAg）［62］。 人circ-FBXW7也 含 有 IRES，可編碼21 kD的蛋白質，抑制U251和U373癌細胞的增殖［63］。部分circRNA雖無IRES，仍能結合核糖體啟動翻譯。如在人和小鼠的成肌細胞中發(fā)現(xiàn)具有開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［17］的circZNF609可翻譯蛋白質。Pamudurti等［64］在果蠅大腦組織中通過核糖體印跡鑒定出circMBL的終止密碼子處有核糖體結合，并通過蛋白質譜分析得到了circRNA翻譯的蛋白質。研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾會促進circRNA的翻譯［17］，皆因此類circRNA起始密碼子上含有RRACH（R=G或A；H=A、C或U），該序列中的A堿基可被甲基化酶復合體METTL3/14甲基化，促使YTHDF3可之結合，并招募eIF4G2和其他翻譯起始因子，啟動circRNA的翻譯［17］。此cricRNA沒有終止密碼子，若翻譯起始，circRNA的環(huán)狀結構可使核糖體通過類似滾環(huán)擴增（Rolling circle ampli fi cation，RCA）的機制參與多肽延長。

4.5 circRNA參與細胞通訊和信號轉導

也有報道circRNA可調控細胞通訊和信號轉導。血清等外泌體的circRNA與胞質中存在顯著差異，表明circRNA進入外泌體是一個選擇性過程，可能作為細胞間物質傳遞、信息交流的途徑［29］。分泌小泡（含外泌體）中circRNA比線性RNA比例較高［65］，表明分泌小泡是細胞選擇性釋放和清除內源性circRNA的一種機制。CircRNA也可調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，例如mcircRasGEF1B可調控脂多糖（LPS）誘導的細胞間黏附因子（ICAM-1）mRNA的穩(wěn)定性，敲低mcircRasGEF1B會影響LPS誘導的ICAM-1的表達［66］。

綜上所述，circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的分子，具有不同的分子特點和形成機制，關于其功能研究還有待深入。circRNA在物種中具有較高的序列保守性，具有調控機體生長發(fā)育和新陳代謝的功能，在遺傳品種改良和品系選育的工作中，有望作為分子育種的新靶點。

5 circRNA在畜禽中的研究進展

畜禽的經(jīng)濟性狀與疾病防控是動物科學關注的重點。近年來，circRNA在該領域的研究也是如火如荼，為挖掘農(nóng)業(yè)動物重要經(jīng)濟性狀遺傳機制和調控網(wǎng)絡提供了新思路。

5.1 circRNA在家畜中的研究進展

家畜繁殖機能、生長發(fā)育、肌肉發(fā)育、脂肪沉積、產(chǎn)毛（絨）量、產(chǎn)奶量和疾病發(fā)生等是畜牧業(yè)關注的重要經(jīng)濟性狀。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA參與家畜大腦、卵巢、肌肉、脂肪、心臟、肝臟和乳腺等性狀的發(fā)育和疾病發(fā)生過程。

在肌肉和脂肪發(fā)育方面，Liang等［67］從貴州小型豬脂肪、心肌等9種不同組織及3個發(fā)育階段的骨骼肌中鑒定出了5 934個circRNA，繪制了豬circRNA的時空表達譜，確定了149個與肌肉生長發(fā)育、肌肉收縮、染色質修飾、陽離子平衡、ATP水解耦合的陽離子轉運、細胞緊密連接及鈣離子信號通路有關的circRNA。并構建了首個小型豬的circRNA數(shù)據(jù)庫。Chen等［68］采集180 d和8年雅南母豬的心肌和背最長肌，通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)了心肌樣本中26個mRNA、4個lncRNA、22個miRNA和26個circRNA差異表達；骨骼肌樣本中81個 mRNA、5個 lncRNA、79個 miRNA和 62個circRNA差異表達，由此可見心肌和骨骼肌的衰老過程中存在差異。在肌肉老化過程中，Chen等［68］還評估了多重共調控關系，構建了circRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，為研究肌肉老化的分子機制提供了良好的基礎。Sun等［69］研究藍塘豬和長白豬肌肉組織中差異表達的編碼基因、lncRNA、circRNA及miRNA，結果在藍塘豬中發(fā)現(xiàn)有1 401個circRNA高表達，2 959個circRNA低表達，其中有236個是與肌肉發(fā)育相關的，并發(fā)現(xiàn)有40個circRNA參與miRNA介導的ceRNA調控網(wǎng)絡。

Li等［70］利用RNA-Seq方法研究胚胎期和成年期哈薩克羊背最長肌組織中的circRNA，共鑒定出6 113個circRNA，功能分析發(fā)現(xiàn)circRNA的母基因主要富集在肌肉生長和發(fā)育相關的信號通路，oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和 oar_circ_0001099具有肌肉發(fā)育相關miRNA的多重保守位點。Wei等［71］分析胚胎期和成年期秦川牛的背最長肌中差異表達的circRNA，共鑒定出12 981個circRNA，其中有624個在成年牛中高表達，204個低表達。典型的是circLMO7，過表達circLMO7會吸附miR-378a-3p抑制成肌細胞分化，使得細胞周期中S期細胞數(shù)量增加，G0/G1期細胞數(shù)量減少，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。同課題組Li等［11］發(fā)現(xiàn)circFUT10可以結合miR-133a促進成肌細胞分化，使得細胞周期中G0/G1期細胞數(shù)量增加，S期細胞數(shù)量減少，抑制細胞增值，促進細胞凋亡。Li等［72］發(fā)現(xiàn)circFGFR4可以吸附miR-107，促進Wnt3a基因表達，進而促進成肌細胞分化誘導細胞凋亡，對細胞增殖沒有顯著影響。

在大腦和生殖系統(tǒng)研究方面，Ven?等［73］對豬胚胎發(fā)育期大腦組織測序共發(fā)現(xiàn)4 634個circRNA具有時間表達差異，皮質部circRNA的表達豐度最高，這表明circRNA對于豬胚胎期腦部發(fā)育具有重要調控作用。Li等［74］利用RNA-seq研究產(chǎn)前、產(chǎn)后哈薩克羊腦垂體中差異表達的circRNA發(fā)現(xiàn)，大量的circRNA參與垂體激素分泌及相關通路，oar_circ_0000059具有58個與垂體相關的miRNA結合位點，并且40個circRNA包含至少1個IREs和ORF，這表明circRNA廣泛參與垂體的發(fā)育和分泌功能。Tao等［75］通過麻城黑山羊和波爾山羊排卵前后卵泡組織RNA-seq分析，共檢測出1 395個circRNA，其中有37個差異表達。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)大量circRNA參與卵巢類固醇生成和P53信號通路。其中chi_circ_0008219可與3個卵泡相關的miRNA相結合，表明circRNA對母羊卵巢卵泡有潛在影響。

在泌乳性能研究方面，Zhang等［76］研究產(chǎn)后90 d和250 d荷斯坦奶牛乳腺組織中差異表達的circRNA，共鑒定出6 621個circRNA，其中有2 231個共表達。功能富集分析發(fā)現(xiàn)來源于4個酪蛋白 編 碼 基 因（CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3）的circRNA在90 d奶牛乳腺組織中高表達，這些circRNA也具有miR-2284的結合位點，而miR-2284可與CSN1S1和CSN2的mRNA結合，由此猜測這些circRNA可能參與酪蛋白的表達調控。Zhu等［77］對分娩后1、7和21 d大鼠的乳腺組織高通量測序，發(fā)現(xiàn)并鑒定了來源于Tc2n基因Exon10和Exon11的circRNA（cTc2n）。定量檢測發(fā)現(xiàn)cTc2n在乳腺中高表達。cTc2n在這三個時間點的表達變化呈現(xiàn)先顯著下降、后輕微上升的趨勢，而Tc2nmRNA呈現(xiàn)相反的趨勢。生信分析發(fā)現(xiàn)cTc2n不存在miRNA結合位點，而Exon10和Exon11編碼Tc2n蛋白的保守區(qū)域，推測cTc2n可抑制Tc2nmRNA的產(chǎn)生。

在動物疾病發(fā)生研究方面，小鼠作為畜牧學科研究的模式動物，在家畜研究中應用廣泛，尤其是在疾病研究方面。Pei等［78］通過將小鼠暴露在氡輻射的條件中，通過對肺組織RNA-aeq發(fā)現(xiàn)107個circRNA上調，83個circRNA下調，其中30個高表達的circRNA具有多個miRNA結合位點，表明circRNA可能參與氡誘發(fā)的肺損傷的病理變化。Huang等［79］對水迷宮測試后的5月齡、10月齡SAMP8鼠和SAMR1鼠的海馬體RNA-seq，發(fā)現(xiàn)mmu_circRNA_017963與自噬體組合、胞外分泌、細胞凋亡、RNA剪接、突觸囊泡循環(huán)等多個過程，表明circRNA參與阿茲海默癥的發(fā)生。Errichelli等［40］通過體外培養(yǎng)老鼠和人的胚胎干細胞，改變RNA結合蛋白FUS的表達水平，檢測circRNA的變化，發(fā)現(xiàn)FUS可結合到側翼內含子區(qū)，調節(jié)circRNA的形成。關于人腫瘤研究中，活體實驗常在小鼠皮下異體移植人癌變的腫瘤，再通過注射過表達載體或干擾片段來改變特定circRNA的表達，研究發(fā)現(xiàn)circRPKCI［80］、circ-Amotl1［81］、circCDYL［82］、circHIPK3［83-84］、hsa_circ_0007385［85］、hsa_circ_00126-73［86］、circCCDC66［87］和 circRNA_100782 等 circRNA 分子可促進腫瘤生長，circ-FBXW7［63］、circ-ITCH［88］、circC3P1［89］、circFoxo3［90］和cirZKSCAN1［91］等circRNA分子可抑制腫瘤生成。

5.2 circRNA在家禽中的研究進展

在家禽的研究中，circRNA在生長發(fā)育、肌肉發(fā)育、產(chǎn)蛋量和疾病防治中的作用是人們主要關注的內容。

Ouyang等［60-61］采 集 11胚 齡（E11）、16胚齡（E16）、1日齡（P1）杏花雞母雞的腿肌，通過RNA-seq共鑒定出13 377個circRNA，其中有1 470個差異表達，有946個circRNA具有一個或多個miRNA結合位點，共涉及150個已知miRNA分子。進一步分析發(fā)現(xiàn)雞circRBFOX2.2-3和circRBFOX2.2-4可吸附miR-206，促進雞成肌細胞增殖，抑制成肌細胞分化，雞circSVIL.6-14可結合miR-203，促進成肌細胞增殖和分化［12，92］。利用iTRAQ技術鑒定出差異表達蛋白，并與circRNA的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，結果在E11 和 P1比較組發(fā)現(xiàn)23個差異蛋白基因具有差異表達的circRNA。包括肌肉收縮通路相關的基因DMD、TNNT3、TNN、TPM1、TPM2和TPM3，其中DMD和TNN基因含有多個差異的circRNA［60］。由此可見，在雞胚胎期肌肉發(fā)育過程中，circRNA通過吸附miRNA或參與調控蛋白表達等方式調控肌肉發(fā)育。

此外，Zhang等［93］用雞禽白血病 J（ALV-J）亞型侵染ALV抗性和ALV敏感性雞，20周后采集肝臟組織。RNA-seq鑒定出1 800多個circRNA，其中有32個circRNA差異表達。且發(fā)現(xiàn)在ALV抗性組中的12個circRNA存在多個miRNA分子結合位點，基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)主要集中于免疫通路。這表明circRNA可能參與ALV-J引起的免疫過程。

6 展望

目前對于circRNA的研究仍處于起步階段，有大量技術問題需要突破。隨著高通量測序和生物信息學的快速發(fā)展，將會有越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，其功能研究會越來越深入。circBase［94］、Circ2Traits［95］、CircNet［96］等數(shù)據(jù)庫中收錄了近 10萬circRNA測序結果，并能預測circRNA-miRNA-mRNA相互作用。circRNA過表達載體和干擾手段不斷趨于成熟，使人工調控細胞內circRNA的表達成為可能，利于進一步探索circRNA的功能［18，97］。CircRNA與疾病發(fā)生密切相關，可作為癌癥等疾病監(jiān)測的新型靶標分子［58］。在畜禽研究方面，主要集中在生長發(fā)育、肌肉發(fā)育等經(jīng)濟性狀相關的circRNA的研究。對于circRNA的功能注釋僅限于circRNA的來源編碼基因或可能的miRNA結合位點進行預測分析，因此需進一步探索circRNA作用網(wǎng)絡，研究circRNA在基因表達調控的作用，加深畜禽的經(jīng)濟性狀相關circRNA的篩選與鑒定，更好的為畜禽分子育種提供理論依據(jù)和技術指導。