毛楷林，林 芳，徐 騰，余作挺，周海龍*

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228）

腫瘤是人類健康的頭號(hào)殺手之一，調(diào)查表明每個(gè)人一生中患癌癥的機(jī)率為22%[1]。多年來研究人員對(duì)腫瘤開展了廣泛的研究，但其病因尚未完全確定。而現(xiàn)有的腫瘤治療方法多有較大的副作用，因此尋找新型藥物以及新的藥物靶點(diǎn)是現(xiàn)階段研究人員的主要工作之一。在眾多腫瘤中，肺癌是最常見惡性腫瘤之一，尤其在工業(yè)化程度較高的地區(qū)，空氣污染情況嚴(yán)峻，肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署估計(jì)，2008年全球約有161萬新發(fā)肺癌病例，死亡138萬 例，居惡性腫瘤之首[2]。而在我國(guó)，肺癌發(fā)病率及死亡率也居首位，并且呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[3-4]。

海鞘是一種脊索動(dòng)物，廣泛分布于各大海域，品種繁多、形狀各異，并且在韓國(guó)、日本等國(guó)被作為一種風(fēng)味食物。皺瘤海鞘是中國(guó)南海的優(yōu)勢(shì)種，繁殖高峰期間密度可達(dá)到2 225 個(gè)/m3[5]。近年來對(duì)于海洋天然產(chǎn)物的大量研究表明，海鞘體內(nèi)存在大量的具有多種生物活性的天然物質(zhì)，這些物質(zhì)顯示出多種多樣的生物活性，例如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎癥、抑制血管生成等[6-8]，其中尤其以抗腫瘤活性最為突出[9-11]，目前有幾種成分已經(jīng)通過或正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，2015年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在美國(guó)上市的抗腫瘤藥物曲貝替定（Trabectedin）就是從加勒比海鞘（Ecteinascidia turbinata）體內(nèi)提取得到[12]，用于不能手術(shù)切除或特定的晚期軟組織肉瘤的治療。皺瘤海鞘由被囊及內(nèi)臟團(tuán)兩部分組成，被囊較為堅(jiān)韌且具有韌性，能夠抵御環(huán)境的變化；內(nèi)臟團(tuán)呈現(xiàn)橙紅色，柔軟且富含水分。以往多將海鞘作為一個(gè)整體來研究，而本課題組前期的結(jié)果表明，海鞘被囊與內(nèi)臟團(tuán)提取物的生物活性差異很大，所含的物質(zhì)成分也迥然不同[13]，因此本實(shí)驗(yàn)將海鞘分為被囊及內(nèi)臟團(tuán)兩個(gè)部分進(jìn)行研究。

海鞘目前被認(rèn)為是一種污損生物，不但不具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還與水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成損失。因此，通過對(duì)皺瘤海鞘進(jìn)行系統(tǒng)的開發(fā)研究，生產(chǎn)出具有高附加值以及廣闊市場(chǎng)前景的產(chǎn)品，可以極大地減少海鞘資源的浪費(fèi)，同時(shí)增加水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的收入。本實(shí)驗(yàn)通過現(xiàn)代提取及純化技術(shù)對(duì)皺瘤海鞘不同部位進(jìn)行提取，得到具有較高抗腫瘤活性的皺瘤海鞘組分，為進(jìn)一步開發(fā)海鞘功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺瘤海鞘于2016年9月采自海南省陵水縣黎安鎮(zhèn)港口，根據(jù)《中國(guó)海洋生物圖集》（第七冊(cè)）對(duì)其種類鑒定為皺瘤海鞘（Styela plicata）。人肺癌A549細(xì)胞由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸、青霉素鏈霉素混合液 美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Sigma公司；四氮甲唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT） 美國(guó)Amersco公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；柱層析硅膠、薄層層析硅膠板青島海洋化工廠；其他有機(jī)溶劑（均為分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀、HEPA class 100 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientific公司；H1850R低溫高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SCIENTZ-10N多歧管普通型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；FACS-CANTO II型流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DM6000熒光顯微鏡德國(guó)LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將皺瘤海鞘樣品用自來水洗凈，去除表面附著物，剪開被囊取出內(nèi)臟團(tuán)，將被囊與內(nèi)臟團(tuán)分別于冷凍干燥機(jī)中凍干72 h后放入粉碎機(jī)中粉碎至40 目，粉碎過程中控制溫度不超過50 ℃。

1.3.2 甲醇提取物的制備

分別稱取皺瘤海鞘被囊粉與內(nèi)臟團(tuán)粉各15 g于250 mL錐形瓶中，加入150 mL甲醇，放入攪拌子，將錐形瓶放于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?8 h。用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，將上清液收集于另一玻璃瓶中。向?yàn)V渣中再次加入100 mL甲醇，同法處理2 次。合并3 次提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下減壓蒸發(fā)至浸膏質(zhì)量不再變化，將被囊浸膏和內(nèi)臟團(tuán)浸膏分別收集至5 mL離心管中，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.3 硅膠柱層析分離

在43 cm×3 cm的層析柱內(nèi)加入100 g柱層析硅膠，采用濕法裝柱，之后將2 g左右的海鞘被囊甲醇提取物（tunic methanol extract，TME）或內(nèi)臟團(tuán)甲醇提取物（visceral methanol extract，VME）與硅膠填料拌勻上柱，按照如下順序洗脫：100%（體積分?jǐn)?shù)，下同）正己烷；75%正己烷-二氯甲烷溶液；50%正己烷-二氯甲烷溶液；25%正己烷-二氯甲烷溶液；100%二氯甲烷；75%二氯甲烷-甲醇溶液，50%二氯甲烷-甲醇溶液，25%二氯甲烷-甲醇溶液；100%甲醇。每份洗脫液300 mL，在洗脫過程中用薄層色譜檢測(cè)是否已經(jīng)洗脫完全，如果未洗脫完全，仍然可以繼續(xù)洗脫。將薄層色譜檢測(cè)為成分相同的洗脫液合并，40 ℃減壓濃縮至干，稱質(zhì)量。

1.3.4 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周傳代2 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，傳代次數(shù)不超過15 次。

1.3.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率

用移液器將細(xì)胞懸液加入表面處理過的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)液，加入樣品溶液，放入培養(yǎng)箱48 h。向樣品溶液中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。倒去液體，每孔加入150 μL DMSO，在室溫、避光條件下輕柔振蕩培養(yǎng)板1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處OD值。實(shí)驗(yàn)設(shè)A549細(xì)胞陰性對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組以及調(diào)零組。陽性藥物對(duì)照為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），質(zhì)量濃度20 μg/mL；陰性對(duì)照加入與最大供試藥物相同質(zhì)量濃度的DMSO（藥物溶劑），細(xì)胞數(shù)量與其他孔相同；調(diào)零孔加入相同體積的DMEM培養(yǎng)基（無細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)組樣品每個(gè)質(zhì)量濃度（0（空白組）、25、50、75、100、200、300、400 μg/mL）設(shè)5 個(gè)平行孔。96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前在邊緣孔都加入100 μL的無菌PBS，防止產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。細(xì)胞相對(duì)存活率按式（1）計(jì)算。

式中：ODT為樣品孔OD值；ODZ為調(diào)零孔OD值；ODN為陰性對(duì)照孔OD值。

1.3.6 半數(shù)抑制濃度的測(cè)定

用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度從低到高的6 種樣品溶液（31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL），并設(shè)陰性對(duì)照組（加入與樣品溶液最大質(zhì)量濃度相同的DMSO（藥物溶劑），細(xì)胞數(shù)量與其他孔相同），孵育細(xì)胞24 h，用1.3.5節(jié)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，并用GraphPad prism 6.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度。

1.3.7 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將A549細(xì)胞置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，加入不同質(zhì)量濃度（80、160、320 μg/mL）的樣品溶液，同1.3.6節(jié)設(shè)置陰性對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)板置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.8 細(xì)胞凋亡觀察與分析

細(xì)胞經(jīng)過樣品（質(zhì)量濃度0（空白組）、80、160、320 μg/mL）處理48 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡。首先用不含乙二胺四乙酸的細(xì)胞消化液消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，收集（1×106）～（3×106）個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS離心洗滌兩次，棄上清液。加入500 μL凋亡陽性質(zhì)控液重懸，置于冰上孵育30 min。用預(yù)冷PBS離心洗滌，棄上清液。加入適量4 ℃預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸，并加入數(shù)量相同且未經(jīng)處理的活細(xì)胞與之混合。加入4 ℃預(yù)冷結(jié)合緩沖液補(bǔ)充至1.5 mL，等分成3 管，其中一管為空白對(duì)照，另兩管為單染管。單染管分別加入5 μL Annexin V-FITC或10 μL PI，室溫避光孵育5 min。在流式細(xì)胞儀上，用空白管調(diào)節(jié)前向散射光、側(cè)向散射光和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下用單染管調(diào)節(jié)熒光通道的補(bǔ)償。離心收集（1×105）～（5×105）個(gè)細(xì)胞，取500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。輕柔漩渦混勻后，室溫避光孵育5 min。在流式細(xì)胞儀上，通過FITC檢測(cè)通道檢測(cè)Annexin V-FITC，激發(fā)波長(zhǎng)Ex＝488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em＝530 nm；通過PE檢測(cè)通道檢測(cè)PI。同時(shí)，滴加20 μL用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于凹槽載玻片上，并用蓋玻片蓋住細(xì)胞，在熒光顯微鏡（200×）下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化和染色結(jié)果。

1.3.9 GC-MS檢測(cè)高活性組分的化學(xué)成分

1.3.9.1 GC條件

色譜柱：Hp-5ms毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：前進(jìn)樣口吹掃流速3 mL/min，起始柱溫80 ℃，保持2 min，以6 ℃/min的升溫速率升至300 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流進(jìn)樣，分流比：5∶1。

1.3.9.2 MS條件

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描范圍m/z 20～450。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果利用MS數(shù)據(jù)系統(tǒng)（NIST 2008）檢索匹配對(duì)應(yīng)的化合物，每種化合物的相對(duì)含量由儀器軟件得出。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20軟件處理數(shù)據(jù)，MTT檢驗(yàn)數(shù)據(jù)來自5 次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果用±s表示，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小差異顯著法進(jìn)行顯著性比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皺瘤海鞘TME和VME對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖1 皺瘤海鞘甲醇提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of methanol extracts from Styela plicata on the proliferation of A549 cells

不同質(zhì)量濃度的皺瘤海鞘TME和VME作用于A549細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的存活率均具有一定影響。由圖1可知，TME以及VME在低質(zhì)量濃度（25～75 μg/mL）條件下孵育，對(duì)于細(xì)胞的增殖沒有抑制作用；隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞相對(duì)存活率均明顯下降。100 μg/mL VME處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞相對(duì)存活率僅為27.85%，低于陽性藥物對(duì)照組（37.80%）。而隨著VME質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞相對(duì)存活率沒有繼續(xù)下降，反而有升高趨勢(shì)，表明100 μg/mL是VME抑制A549細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度。TME在100～400 μg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞相對(duì)存活率降低，最低達(dá)到48.75%，表明TME抑制A549細(xì)胞相對(duì)增殖具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 皺瘤海鞘TCEF和VCEF對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖2 皺瘤海鞘甲醇提取物硅膠柱層析組分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different silica column chromatographic fractions from the methanol extracts on the proliferation of A549 cells

由圖2可知，被囊柱層析組分（column eluted fractions from tunic extract，TCEF）及內(nèi)臟團(tuán)柱層析組分（ column eluted fractions from visceral extract，VCEF）作用于A549細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率具有一定影響。用100 μg/mL TCEF-1～7孵育A549細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率沒有明顯抑制作用，而TCEF-8、9對(duì)細(xì)胞有顯著抑制作用，孵育48 h后細(xì)胞相對(duì)存活率分別為66.57%及71.26%。從整體水平上看，VCEF對(duì)于A549細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于TCEF，其中，VCEF-3、5、6、7、9對(duì)于A549細(xì)胞的相對(duì)抑制率都在40.00%以上，尤其是VCEF-6作用于細(xì)胞48 h后，細(xì)胞相對(duì)存活率僅為25.75%，抑制作用強(qiáng)于陽性藥物對(duì)照組（37.80%）。

2.3 VCEF-6處理對(duì)A549細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的影響

圖3 VCEF-6抑制A549細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度曲線Fig.3 Half inhibition concentration curve of VCEF-6 on the proliferation of A549 cells

由圖3可知，VCEF-6對(duì)于A549細(xì)胞的抑制具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，24 h半數(shù)抑制濃度為168.7 μg/mL，表明VCEF-6具有較強(qiáng)的抑制A549細(xì)胞活性。

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖4 倒置相差顯微鏡對(duì)A549細(xì)胞觀察結(jié)果（×200）Fig.4 Morphological changes of A549 cells under an inverted phase contrast microscope (× 200)

如圖4所示，陰性對(duì)照組的A549細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰平整并且排列緊密。VCEF-6作用48 h后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞密度比陰性對(duì)照組減小，80 μg/mL VCEF-6處理組A549細(xì)胞出現(xiàn)膜皺縮，形態(tài)不規(guī)則；160 μg/mL VCEF-6處理組細(xì)胞輪廓模糊，貼壁性下降；320 μg/mL VCEF-6處理組細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞皺縮程度也急劇增加，與陰性對(duì)照組正常細(xì)胞有明顯區(qū)別，同時(shí)在培養(yǎng)基中出現(xiàn)許多懸浮的死細(xì)胞。

2.5 細(xì)胞凋亡觀察與分析結(jié)果

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由細(xì)胞內(nèi)基因控制其發(fā)生的有序的、自主的死亡。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前所有癌癥治療手段中最有效的手段之一，而凋亡敏感性的喪失是細(xì)胞由正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗癄顟B(tài)的主要標(biāo)志之一。何雅軍等[14]的研究表明，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法能夠準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡的過程，可作為檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡的方法。本實(shí)驗(yàn)以Annexin V-FITC/PI雙染料對(duì)VCEF-6處理的A549細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡對(duì)染色的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡觀察與分析。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大部分被VCEF-6處理的細(xì)胞與Annexin V-FITC/PI染料結(jié)合后，呈現(xiàn)綠色和紅色，表現(xiàn)出典型的凋亡特征。而未被VCEF-6處理的細(xì)胞幾乎沒有與Annexin V-FITC/PI染料結(jié)合。隨著VCEF-6質(zhì)量濃度的增大，早期凋亡與晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量也發(fā)生變化。80 μg/mL及160 μg/mL質(zhì)量濃度下被FITC染色的細(xì)胞相對(duì)較多，表明在這兩個(gè)質(zhì)量濃度下早期凋亡細(xì)胞所占例比較高。而當(dāng)VCEF-6質(zhì)量濃度增大到320 μg/mL時(shí)，被PI染色的細(xì)胞相對(duì)增多，表明在該質(zhì)量濃度下晚期凋亡細(xì)胞占比較多（圖5C）。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著VCEF-6質(zhì)量濃度的增大，能與Annexin V-FITC/PI結(jié)合的被V C E F-6處理的A 5 4 9細(xì)胞也增多（圖5A）。VCEF-6質(zhì)量濃度從0 μg/mL時(shí)增大至320 μg/mL時(shí)，A549細(xì)胞的總凋亡率（早期凋亡率（Q2象限）與晚期凋亡率（Q4象限）之和）從13.30%增加到30.27%（圖5B），表明VCEF-6具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

圖5 VCEF-6質(zhì)量濃度對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 A549 cell apoptosis induced by different concentrations of VCEF-6

2.6 VCEF-6的化學(xué)成分分析

圖6 VCEF-6的GC-MS總離子流圖譜Fig.6 Total ion current chromatogram from GC-MS analysis of VCEF-6

表1 VCEF-6化合物成分分析Table1 Chemical composition analysis of VCEF-6

經(jīng)過MS數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索（NIST 2008）以及人工譜圖解析確定出VCEF-6的化學(xué)成分，結(jié)果見圖6、表1。從VCEF-6中共檢測(cè)并鑒別出22 種組分，包括烷烴類6 種、甾醇類6 種、脂肪酸酯類6 種、芳香族化合物4 種。其中相對(duì)含量大于1%的有膽甾醇（34.46%）、麥角甾-5,22-二烯-3-醇（3.82%）、鏈甾醇（2.00%）、豆甾-5,24（28）-二烯-3-醇（1.98%）、穿貝海綿甾醇（1.94%）、十六酸甲酯（1.90%）、豆甾醇（1.44%）、硬脂酸甲酯（1.43%）。

3 討 論

近年來，海鞘在抗腫瘤天然產(chǎn)物的研究中脫穎而出，在首先進(jìn)入臨床階段的6 個(gè)海洋來源的抗腫瘤藥物中，3 個(gè)來源于海鞘，此外還有大批候選化合物也正在研究中。Liberio等[15]從143 種海鞘提取物中鑒定出一種雙吲哚生物堿eusynstyelamide B，對(duì)于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的半數(shù)抑制濃度僅為5 μmol/L。Palanisamy等[16]利用高效液相色譜法分離出皺瘤海鞘甲醇提取物的不同組分，并分別檢測(cè)其對(duì)腫瘤HeLa細(xì)胞的抑制活性，其中SP-50組分抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)最為明顯，半數(shù)抑制濃度僅為33 μmol/L；值得注意的是，SP-50對(duì)于人正常細(xì)胞BJ-EHLT沒有顯著的毒性，表明該組分對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制具有選擇性，亟待進(jìn)行深入研究。2012年，一種來源于Ciona savignyi海鞘的抗腫瘤多肽CS5931被分離出來，其對(duì)于HeLa、A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為18.132 mg/mL和105.732 mg/mL，進(jìn)一步的研究表明，該多肽是通過線粒體介導(dǎo)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。Cheng Linyou等[18]從Ciona intestinalis L.海鞘中提取得到的一種小分子水溶性化合物CI431，對(duì)腫瘤細(xì)胞有極強(qiáng)的抑制活性，對(duì)于A549、HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為39.472 μg/mL和30.417 μg/mL。羅寧等[19]研究了皺瘤海鞘乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，對(duì)于MCF-7以及HuH-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為1 695.785 μg/mL和1 763.665 μg/mL。在前人的研究基礎(chǔ)上，本研究選取南海海鞘優(yōu)勢(shì)物種皺瘤海鞘為研究對(duì)象，分別探討其被囊及內(nèi)臟團(tuán)兩部分對(duì)于A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并進(jìn)一步將甲醇提取物按照極性分為9 個(gè)組分，最后篩選出對(duì)于A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)的組分VCEF-6，其24 h半數(shù)抑制濃度僅為168.7 μg/mL。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)的海洋藥物研究起步較晚，而我國(guó)擁有300萬 km2的海洋國(guó)土面積，海洋生物資源豐富；因此，開展海洋天然活性產(chǎn)物的研究迫在眉睫。

研究表明從海鞘體內(nèi)分離得到的活性產(chǎn)物大部分是來源于與其共附生的微生物[20]。Tianero等[21]在對(duì)32 種不同海鞘共附生微生物以及代謝產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)，不同種類的海鞘的共附生微生物具有極大的多樣性，并且具有物種特異性以及地理位置特異性。其中，具有地理位置特異性的代謝產(chǎn)物主要包括一些脂類，而具有物種特異性的代謝產(chǎn)物主要囊括了多種次級(jí)代謝產(chǎn)物。本研究中提取得到的皺瘤海鞘抗腫瘤組分VCEF-6是由海鞘本體產(chǎn)生還是共附生微生物產(chǎn)生，有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。與細(xì)胞凋亡不同，細(xì)胞壞死為被動(dòng)過程，而凋亡是主動(dòng)過程。大量研究表明，細(xì)胞凋亡與腫瘤等許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，目前，許多抗腫瘤藥物作用的主要機(jī)制之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[22-24]。在細(xì)胞凋亡研究中，流式細(xì)胞術(shù)是一種定量的技術(shù)手段，能夠較為精確地測(cè)定出凋亡細(xì)胞占所測(cè)定總細(xì)胞的比例。錢葉等[25]利用流式細(xì)胞術(shù)研究了松乳菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明在質(zhì)量濃度為12.5～50.0 μg/mL范圍內(nèi)，松乳菇多糖顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。趙敬等[26]使用流式細(xì)胞儀研究了姜黃素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)隨著姜黃素質(zhì)量濃度的增大，大量的HeLa細(xì)胞被阻滯在S期，表明姜黃素可能是通過將細(xì)胞阻滯在S期，使其不能進(jìn)入下一增殖周期來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)VCEF-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與空白組相比，不同質(zhì)量濃度VCEF-6處理組的A549細(xì)胞均出現(xiàn)一定程度的凋亡，且隨著VCEF-6質(zhì)量濃度的增加，凋亡率明顯升高。這說明VCEF-6對(duì)A549細(xì)胞的凋亡具有明顯的誘導(dǎo)作用，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

本研究在篩選出對(duì)A549細(xì)胞抑制活性最強(qiáng)的皺瘤海鞘醇提物組分（VCEF-6）的基礎(chǔ)上，采用GC-MS法分析該組分的化學(xué)成分，從中鑒別出22 種化學(xué)成分，包括甾醇類6 種、烷烴類6 種、脂肪酸酯類6 種、芳香族化合物4 種。參考相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)VCEF-6的化學(xué)成分中已報(bào)道的具有抗腫瘤活性的化合物為豆甾醇[27-28]和麥角甾醇[29]，因此，推測(cè)甾醇類組分為VCEF-6發(fā)揮抗腫瘤活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，VCEF-6能夠發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，其機(jī)制可能與中藥及其方劑多組分、多靶點(diǎn)的整合作用相似。中藥由活性物質(zhì)群構(gòu)成，并且按照一定比例組合，活性物質(zhì)群通過多靶點(diǎn)、多途徑經(jīng)整合發(fā)揮作用[30]。VCEF-6的多組分是如何發(fā)揮腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用以及作用于哪些靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以甲醇為溶劑提取得到皺瘤海鞘被囊及內(nèi)臟團(tuán)的醇提物，并用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度醇提物對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明在較低質(zhì)量濃度（25～75 μg/mL）下，被囊及內(nèi)臟團(tuán)醇提物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)沒有抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度增大到100 μg/mL以上時(shí)，其對(duì)于A549細(xì)胞表現(xiàn)出明顯抑制作用。采用硅膠柱層析的方法將皺瘤海鞘醇提物根據(jù)極性分離純化為9 個(gè)不同組分，并分別檢測(cè)其抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)有8 個(gè)組分對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，其中活性最強(qiáng)的組分為VCEF-6，對(duì)于A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為168.7 μg/mL。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)以及熒光顯微鏡觀察表明，VCEF-6強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。最后，使用GC-MS技術(shù)分析VCEF-6的化學(xué)成分，利用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索結(jié)合人工分析鑒定出22 種化合物，其中含量較高的有膽甾醇（34.46%）、麥角甾-5,22-二烯-3-醇（3.82%）、鏈甾醇（2.00%）、豆甾-5,24（28）-二烯-3-醇（1.98%）、穿貝海綿甾醇（1.94%）、十六酸甲酯（1.90%）、豆甾醇（1.44%）、硬脂酸甲酯（1.43%）。