饒 歡，田 陽，李 璽，薛文通,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖中心，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

食物過敏是過敏性疾病中的一種，如今已成為全球關(guān)注的食品公共安全問題。在歐洲，大約2%的成年人和4%～5%的兒童承受著食物過敏帶來的傷害[1]，美國受食物過敏影響的人口是20 年前的2 倍[2]，亞洲的發(fā)病率也呈明顯上升趨勢[3]。然而截至當(dāng)前，依然沒有行之有效的治療方法。因此，深入探究致敏機(jī)制，尋找治療突破點；降低過敏原致敏性，研發(fā)脫敏或低致敏食物；完善致敏評價體系等成為科學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。

食物加工過程中的各種加工工序以及食物成分間發(fā)生的物理化學(xué)變化，均可不同程度地影響食物過敏原的含量和結(jié)構(gòu)，從而增加或降低過敏原致敏性。而過敏原的改變也會影響其消化時的分解方式以及吸收時穿過腸黏膜屏障和呈遞給免疫系統(tǒng)的形式[4-6]。雖然當(dāng)前食物致敏途徑機(jī)制仍不十分明晰，但可以肯定大部分食物過敏原是經(jīng)過人體消化系統(tǒng)消化后而引發(fā)過敏反應(yīng)的。通常認(rèn)為，經(jīng)過食品加工和消化系統(tǒng)處理（蛋白酶水解、低酸、膽鹽等）后，依然保持足夠完整又具有免疫原性的蛋白才具有潛在致敏的可能[7]。

目前，有關(guān)過敏原消化穩(wěn)定性和致敏機(jī)制的研究眾多，大部分是以純化后的過敏原或以單一食物組分作為研究對象[8-11]，雖然可以為后期研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論參考，但與生活中攝入的復(fù)雜食品相差較大，很難反映多重加工、復(fù)雜食物基質(zhì)以及食物消化對過敏原的綜合影響。因此，本研究以復(fù)雜的焙烤食物模型為對象，綜合考察加工、食物組分及消化對小麥和花生過敏原的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NuPAGETMBis-Tris（4%～12%）凝膠、NuPAGETM十二烷基硫酸鋰（lithium lauryl sulfate，LDS）緩沖液（4×，pH 8.4）、Simply-BlueTMsafe-stain、Mark 12TM和SeeBlueTM預(yù)染色蛋白Marker 美國Invitrogen公司；模擬唾液（simulated saliva fluid，SSF）、模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）、胰液混合液（pancreatic mix solution，PMS）、肝混合液（hepatic mix solution，HMS）、改良的Krebs-Ringer（modified Krebs-Ringer，MKR）緩沖液、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鎂、卵磷脂 美國Thermo Fisher公司；人唾液淀粉酶（5 000 U/mL）、胃蛋白酶（4 293 U/mg）、胰蛋白酶（1 685 U/mg）、胰凝乳蛋白酶（40 U/mg）、胰淀粉酶（44.9 U/mg）和脂肪酶（25 200 U/mg） 美國Sigma公司?？贵w均由英國曼徹斯特大學(xué)提供。人過敏血清由河北省第四醫(yī)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Typhoon Trio多功能激光掃描成像儀 美國GE公司；GeneGnome XRQ成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀 賽默飛（上海）公司。

1.3 方法

1.3.1 焙烤食物模型制備

普通餅干和花生餅干是本實驗采用的2種配方的餅干模型，普通餅干中的主要致敏原是小麥，花生餅干由于添加了脫脂花生粉，其主要致敏原為花生和小麥。成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。所有成分經(jīng)混合后，160 ℃烘焙20 min，冷藏備用。

表1 2 種餅干主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table1 Ingredients of two types of model biscuits%

1.3.2 體外消化模型

體外消化模型的建立參照Smith等[12]的方法，包括模擬口腔咀嚼、腸胃酶系、離子環(huán)境、溫度及pH值，以再現(xiàn)人體消化環(huán)境。體系中模擬體液的用量及消化酶加入量均根據(jù)食物材料中的蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂肪含量確定，可以更準(zhǔn)確反映人體實際消化環(huán)境。

模擬口腔咀嚼：將含有人唾液淀粉酶和溶菌酶的0.38 mL SSF，以及1.2 mL水，加入0.65 g餅干（m（食物）∶m（SSF）∶V（水）＝1.00∶0.59∶1.86）中，37 ℃水浴攪拌1 min。將此咀嚼樣品放在冰上冷卻待蛋白質(zhì)分析。

模擬胃部消化：向2.24 g咀嚼樣品中加入含有胃蛋白酶的1.05 mL SGF（m（咀嚼樣品）∶V（SGF）＝1.00∶0.46，用1 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至2.5，以模擬胃部酸性環(huán)境。留一個咀嚼樣品加入不含有胃蛋白酶的SGF，作為溶劑對照，記為Gu。將所有樣品置于37 ℃、170 r/min水浴振蕩器中，分別消化0.3、2、4、11、22、33、44、55、66、77 min和120 min。加入0.5 mol/L NaHCO3將pH值升高至7.5，以停止消化，并將消化后樣品置于冰上冷卻待蛋白質(zhì)分析。

模擬十二指腸消化：取11 min胃消化物用于隨后的十二指腸模擬消化。胃消化產(chǎn)物平均分入7支試管中（其中一支試管中的食糜只加入試劑和不含蛋白酶的消化液，作為溶劑對照，記為Du），加入1 mol/L HCl溶液將消化物pH值降至2.5，再加入0.07 mL HMS和含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰淀粉酶和脂肪酶的PMS，并用MKR緩沖液將pH值調(diào)至6.5。將所有樣品置于37 ℃，170 r/min振蕩水浴中溫育0.3、5、15、30、60 min和120 min。加入250 μL 0.1 mol/L蛋白酶抑制劑以終止蛋白水解消化反應(yīng)。

1.3.3 SDS-PAGE檢測消化穩(wěn)定性

所有消化后的餅干樣品，包括胃消化各個時間點和腸消化各個時間點樣品，經(jīng)13 000×g離心20 min后，分離上清液和沉淀，制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品。50 μL上清液中加入25 μL 200 mmol/L二硫蘇糖醇和25 μL NuPAGE LDS緩沖液，90 ℃加熱5 min，冷卻后上樣。取10 mg沉淀和10 mg未經(jīng)消化的原餅干樣品，加入500 μL蛋白提取液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2 g/100 mL CHAPS、50 mmol/L二硫蘇糖醇，pH 8.8），60 ℃水浴超聲處理15 min，之后16 000×g離心30 min，取75 μL上清液加入25 μL NuPAGE LDS緩沖液，90 ℃加熱5 min，冷卻后上樣。

將7 μL各個樣品與蛋白Marker分別上樣到4%～12%NuPAGE Bis-Tris預(yù)制凝膠中，200 V恒壓電泳35 min。凝膠在固定液（體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液、體積分?jǐn)?shù)10%醋酸溶液）中孵育2 h后，用蒸餾水洗膠3 次，每次5 min。Simply-BlueTMsafe-stain染色2 h后，脫色過夜，Typhoon Trio掃描儀成像。

1.3.4 Western-blot測定免疫活性

經(jīng)胃部消化的所有樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，將進(jìn)行免疫印跡實驗。將SDS-PAGE凝膠和硝酸纖維素膜浸泡在轉(zhuǎn)膜液（125 mmol/L甘氨酸、體積分?jǐn)?shù)20%甲醇、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3）中10 min，15 V半干轉(zhuǎn)膜20 min。將膜在TBS-T（Tween 20體積分?jǐn)?shù)0.05%）洗滌緩沖液中洗滌10 min，然后在5 g/100 mL脫脂奶粉（封閉緩沖液）中封閉2 h。封閉完成后，洗膜3 次，每次5 min，4 ℃孵育一抗過夜（鼠抗G12、0610和R5，1∶1 000封閉液稀釋；兔抗Ara h 1、Ara h 3和Ara h 2/6，1∶5 000封閉液稀釋）。洗膜3 次，每次15 min，二抗（辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊-抗鼠或羊-抗兔，1∶10 000封閉液稀釋）室溫孵育1 h，洗滌4 次，每次15 min。使用增強型化學(xué)發(fā)光檢測印跡，并通過化學(xué)發(fā)光儀GeneGnome XRQ成像系統(tǒng)成像。

1.3.5 ELISA評價致敏性

實驗采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的方法對消化前后樣品致敏性進(jìn)行評價。分別收集花生和小麥過敏人群的血清各3 個，分別混合建立花生過敏血清池和小麥過敏血清池。待測蛋白樣品用包被液（0.015 mol/L Na2CO3，0.035 mol/L NaHCO3，pH 9.6）稀釋至1 μg/mL，加入100 μL/孔至酶標(biāo)板中，4 ℃靜置過夜。取出后用TBS-T（Tween 20體積分?jǐn)?shù)0.05%）洗滌4 次，除去殘留液體和氣泡。每孔加入200 μL 0.5%牛血清白蛋白封閉液，37 ℃孵育2 h后，TBS-T洗滌4 次，拍干。加入1∶10封閉液稀釋的血清，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，取出后TBS-T洗滌4 次，拍干。隨后每孔加入100 μL 1∶10 000封閉液稀釋的羊抗人HRP-免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌4 次，拍干。3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液50 μL/孔加入酶標(biāo)板，37 ℃避光孵育15 min。每孔迅速加入50 μL 2 mol/L硫酸終止液，終止顯色反應(yīng)。450 nm波長處測定各孔OD值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗均重復(fù)3 次，采用SPSS軟件的ANOVA對結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，并用SigmaPlot 12.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化對餅干中蛋白消化穩(wěn)定性的影響

2.1.1 口腔-胃消化對餅干中蛋白消化穩(wěn)定性的影響

圖1 體外口腔-胃部消化對蛋白消化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of oral and gastric digestion on protein digestibility of biscuits

在普通餅干的可溶性組分即上清液蛋白（圖1A1）中可觀察到，未被消化的樣品R中，蛋白分子質(zhì)量分布廣泛，且主要集中于45 kDa左右，還有部分分子質(zhì)量大于100 kDa的蛋白。樣品經(jīng)口腔咀嚼和淀粉酶作用后，大分子蛋白變成相對較小的蛋白，可能是淀粉酶破壞了餅干中的淀粉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使本來聚合的蛋白解離成獨立個體。當(dāng)咀嚼物進(jìn)入胃相，胃蛋白酶迅速分解小麥蛋白，隨著消化時間的延長，越來越多的小分子質(zhì)量多肽出現(xiàn)，蛋白分子質(zhì)量分布范圍約為3～20 kDa。在不可溶組分（圖1B1）中，小麥蛋白依然保持著完整的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但其含量也隨消化時間延長而減少，可能是被消化成可溶蛋白，轉(zhuǎn)移到上清液中。

為探究另一組分的加入是否會影響蛋白消化速率，實驗同時檢測了花生餅干的消化特性。從圖1A2中可見，大多數(shù)蛋白質(zhì)被迅速消化成較穩(wěn)定的蛋白降解片段（＜8 kDa），說明小麥蛋白或花生蛋白的消化速率并未互相影響。對比未被消化的食糜（圖1B1、B2），圖1B2中可觀察到更多的殘留蛋白，如分子質(zhì)量40 kDa的條帶（如圖1B2箭頭所示），可在圖1B1、B2中同時觀察到，且圖1B2中條帶顏色更深，但無法通過SDS-PAGE方法判斷這些條帶屬于小麥蛋白或是花生蛋白。

英國學(xué)者用同樣的消化模型，對比研究了總醇溶蛋白、小麥粉和面包的消化模式，結(jié)果顯示，總醇溶蛋白或小麥粉可以迅速被胃蛋白酶消化，但面包中的小麥蛋白幾乎未被消化，而是在十二指腸中進(jìn)一步消化成小肽[12]。本實驗中，餅干的消化模式更接近于總醇溶蛋白或小麥粉，蛋白在胃部基本被消化。

2.1.2 口腔-胃-腸消化對餅干中蛋白消化率的影響

圖2 體外口腔-胃-腸消化對蛋白消化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of oral, gastric and duodenal digestion on protein digestibility of biscuits

由圖2可知，餅干中大部分蛋白已被胃蛋白酶消化，部分殘存于上清液和沉淀中蛋白會繼續(xù)被腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶等進(jìn)一步消化分解。對十二指腸消化后的可溶性蛋白樣本進(jìn)行的SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，蛋白凝膠中清晰可見的條帶分別屬于不同的蛋白酶，難以確定是否還有未被消化的小麥或者花生蛋白。在不可溶組分中，兩種餅干在40 kDa左右有蛋白條帶（如圖2A箭頭所示），且隨消化進(jìn)行而變少。與普通餅干中沉淀蛋白相比，在花生餅干中出現(xiàn)20 kDa左右的蛋白條帶（如圖2B箭頭所示），并且呈降低趨勢，說明花生中有部分蛋白在這一階段被消化分解。

2.2 體外消化對餅干中致敏蛋白免疫原性的影響

2.2.1 體外消化對小麥過敏原免疫原性的影響

小麥中的α/β-、γ-、ω-醇溶蛋白，低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基和高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基都可引起IgE介導(dǎo)的食物過敏[13-15]。通過不同的抗體來檢測不同類型過敏原可觀察到不同過敏原在消化過程中的變化。0610抗體可檢測醇溶蛋白和低分子質(zhì)量麥谷蛋白，可特定識別QPFP抗原表位[16]；G12抗體可識別最具免疫毒性的片段coeliactoxic 33-mer[17]；R5抗體可檢測一系列醇溶蛋白，可特異性識別QXPFP、QQQFP和LQPFP抗原決定簇[18]。

圖3 體外消化對小麥過敏原的影響Fig.3 Effect of in vitro digestion on wheat allergens

由圖3可知，小麥過敏原被迅速水解成小分子片段，但仍然可以被抗體識別，G12、0610和R5抗體可以分別檢測到20～30、30～65 kDa和25～35 kDa的抗酶解多肽（如圖3箭頭所示）。在消化的開始階段仍有許多“完整”小麥致敏蛋白存在于不溶組分中，但隨著酶解時間延長，它們被降解或溶解于上清液體系中被消化，50 min后基本無清晰條帶檢出。

2.2.2 體外消化對花生過敏原免疫原性的影響

圖4 體外消化對花生過敏原的影響Fig.4 Effect of in vitro digestion on peanut allergens

Ara h 1、Ara h 2/6 和Ara h 3是花生中的主要致敏蛋白，能被大多數(shù)花生過敏患者識別[19-22]，其中Ara h 1是花生中含量最多的致敏蛋白[23]，Ara h 2/6是致敏性最強的致敏蛋白，能被95%的花生過敏患者識別，在歐美一些國家作為花生過敏檢測的指標(biāo)之一[24]。

在消化后的可溶性組分中發(fā)現(xiàn)，未消化的花生餅干R和咀嚼樣品C中可檢測出Ara h 1和Ara h 3，當(dāng)與胃蛋白酶接觸后迅速被消化（圖4A1、A2、A3）。消化0.3 min后已無Ara h 1檢出，但38 kDa左右的蛋白仍可以在消化120 min后被Ara h 3抗體檢出（圖4A2）。Ara h 2/6在消化過程中幾乎無降解，說明其對胃蛋白酶具有較強的抵抗力。在不溶性組分中（圖4B1、B2、B3），即使在消化120 min后，也可以檢測到Ara h 1和Ara h 3，但無法檢測到任何Ara h 2/6。Ara h 2/6是親水蛋白，在消化過程中被完全釋放到水溶液中。

2.2.3 體外消化對餅干致敏性的影響

圖5 體外消化對餅干致敏性的影響Fig.5 Effect of in vitro digestion on biscuit allergenicity

實驗采用過敏人群的血清更能說明樣品致敏性的強弱。從圖5中可以看出，對照組對小麥及花生過敏患者的致敏性均最強。當(dāng)餅干經(jīng)胃部消化11 min后，其致敏性顯著下降。當(dāng)消化120 min后，致敏性極顯著下降，說明隨著消化時間延長，致敏蛋白含量下降或其致敏能力下降，致使餅干的致敏性減弱。

3 討 論

蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性是評價其潛在致敏性的重要參考依據(jù)，體外消化模型常被應(yīng)用于過敏原等對人體有潛在危害的肽類物質(zhì)的檢測中。但蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性和食物過敏的關(guān)系與食物致敏原類別、食物基質(zhì)及食物加工等多因素有關(guān)。一些過敏原在單獨存在的環(huán)境下容易被蛋白酶降解，但若是經(jīng)過加工或與其他成分互相作用后，過敏原的消化穩(wěn)定性和致敏性也將會改變。Martinez等[25]對體外單獨消化乳球蛋白和混合消化乳球蛋白和糖基化腸肽進(jìn)行了對比實驗，發(fā)現(xiàn)混合消化后抗原表位消失，IgE結(jié)合能力下降，說明二者會相互作用改變消化產(chǎn)物，從而降低乳球蛋白的潛在致敏性。還有研究表明，杏仁中的過敏原在巧克力慕斯和蛋糕中較難被蛋白酶水解，這可能是受食物黏度干擾，或是蛋白與食物基質(zhì)（例如：脂肪、巧克力中的類黃酮、糖等）相互作用的結(jié)果[26]。

餅干和面包都是以小麥為原料的食品，但由于兩種食品的加工方式不同，其在胃腸道內(nèi)的消化方式也不同。Simonato等[27]的研究表明，烘焙過程增加了小麥過敏原對蛋白質(zhì)水解的抵抗力，使它們能夠到達(dá)胃腸道，從而引起免疫反應(yīng)。Smith等[12]在分析面包中過敏原難以被消化的原因中也指出，焙烤是重要因素之一。另有研究表明，熱加工產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致過敏原消化穩(wěn)定性提高[28]。但本實驗結(jié)果顯示，雖同為焙烤加工后的食品，餅干中的小麥蛋白和花生蛋白依然容易被胃蛋白酶水解。雖然被降解后的小麥過敏原仍具有可識別的抗原決定簇，但大部分過敏原已失去了完整的蛋白結(jié)構(gòu)。花生蛋白中的主要過敏原，特別是含量最多的Ara h 1基本消失，Ara h 3含量也明顯減少，只有Ara h 2/6可耐受胃蛋白酶水解。有學(xué)者對單一的花生過敏原進(jìn)行體外消化實驗，研究結(jié)果與本實驗結(jié)果一致，均表明Ara h 1易被酶解而Ara h 2/6耐受酶解[29]。從ELISA的實驗結(jié)果可以看出，消化后的餅干仍具有致敏性，可能是因為仍有致敏蛋白未被消化，如Ara h 2，或是被水解的致敏原片段仍具有致敏表位[30]，但總體來說其致敏能力顯著下降。

綜上可知，餅干模型相較于面包模型，過敏原更容易被分解，“完整”過敏原含量更少，理論分析及實驗結(jié)果表明其對機(jī)體的危害更小。分析兩種模型結(jié)果不同的主要原因可能是：1）面團(tuán)經(jīng)發(fā)酵、揉搓以后，面筋蛋白及淀粉形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白酶較難接觸到包裹于內(nèi)部的小麥蛋白。本實驗所用餅干，僅僅是各個原料的混合，分子間締合程度低，蛋白較容易暴露。2）面包中水分含量較高，水分子通過氫鍵與蛋白質(zhì)相互作用，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。而餅干中水分含量低，油脂含量多，分子間不容易形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白酶較容易與表位或者其他官能團(tuán)結(jié)合。接下來的研究，也將從這兩方面進(jìn)一步驗證分析。