曹 芳，王宇峰，于春梅，夏西洋，戴秀亮，楊海燕（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院生殖中心，江蘇213000）

胚胎質(zhì)量是影響臨床治療結(jié)局的重要因素之一，將卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，有利于進(jìn)一步篩選出發(fā)育潛能好的胚胎，相較于卵裂胚，囊胚移植具有更高的種植率[1]。然而，體外環(huán)境不完全等同于體內(nèi)環(huán)境，擴(kuò)大培養(yǎng)后，可能使本來在體內(nèi)可發(fā)育成囊胚的卵裂期胚胎停滯，降低囊胚形成率[2]。影響卵裂期胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結(jié)局的因素是多方面的。不同中心之間因臨床促排卵方案、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境及胚胎和囊胚評(píng)分系統(tǒng)差異等原因，囊胚形成率有所不同[3]。本研究回顧性分析了不同質(zhì)量第3天（D3）胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后總囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，并進(jìn)一步分析了影響總囊胚形成比率及發(fā)育成囊胚速度的因素，探討D3非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)囊胚的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1—8月在本中心行輔助生殖技術(shù)助孕的180對(duì)夫婦患者資料，共收集1009枚D3卵裂期冷凍后剩余胚胎，分為優(yōu)質(zhì)胚胎組（Ⅰ、Ⅱ級(jí)，664枚）及非優(yōu)質(zhì)胚胎組（Ⅲ級(jí)，345枚）?；颊卟辉性虬ㄝ斅压芘枨灰蛩?、子宮內(nèi)膜異位癥等女方因素、雙方免疫因素、男方因素及不明原因不孕。

1.2 方法

1.2.1 囊胚培養(yǎng) 在序貫培養(yǎng)基（瑞典vitrolife公司）中培養(yǎng)至囊胚期，將D3胚胎從G1培養(yǎng)液移入平衡過夜的G2培養(yǎng)液中，于37℃、6%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至第6天（D6）。

1.2.2 胚胎評(píng)分 受精后D3觀察胚胎，按Peter卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估D3胚胎質(zhì)量。Ⅰ級(jí)：卵裂球均勻，透亮，碎片率小于10%。Ⅱ級(jí)：卵裂球稍不均勻，碎片率為10%～20%。Ⅲ級(jí)：卵裂球形狀明顯不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)中有顆?，F(xiàn)象，碎片率為20%～50%。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)均為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級(jí)為非優(yōu)質(zhì)可用胚胎。

1.2.3 囊胚評(píng)分 按照Gamder囊胚評(píng)分法，根據(jù)囊胚擴(kuò)張和孵化的程度將囊胚分成3～6級(jí)：3級(jí)為囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；4級(jí)為囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變??；5級(jí)為囊胚正在從透明帶破裂口中孵出；6級(jí)為囊胚完全從透明帶中脫出。3～6級(jí)囊胚還需對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（TE）進(jìn)行評(píng)分。ICM評(píng)分：A級(jí)為細(xì)胞結(jié)合緊密，數(shù)目多；B級(jí)為細(xì)胞結(jié)合較松散，數(shù)目較少；C級(jí)為細(xì)胞數(shù)目極少。TE評(píng)分：A級(jí)為細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B級(jí)為細(xì)胞數(shù)目較少，較松散；C級(jí)為細(xì)胞數(shù)目極少。本中心規(guī)定第5、6天（D5、D6）囊胚評(píng)分大于或等于4BB級(jí)的胚胎定為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.2.4 觀察指標(biāo) 收集并分析患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)促卵泡素（FSH）水平、不孕原因、不孕類型、人絨毛膜促性腺激素（HCG）日雌二醇（E2）水平、用于囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎質(zhì)量及形成的囊胚數(shù)等資料。根據(jù)胚胎囊胚形成速度分為無囊胚形成亞組、完全D5形成囊胚亞組、完全D6形成囊胚亞組和D5+D6亞組，根據(jù)囊胚總形成情況分為A組（囊胚形成率小于或等于25%）、B組（囊胚形成率大于25%～＜50%）組和C組（囊胚形成率大于50%），比較不同發(fā)育速度的囊胚凍融周期的移植結(jié)局。囊胚形成率=形成的囊胚數(shù)/用于囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%。種植率=移植胚胎數(shù)/著床胚胎數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件對(duì)基本資料及相關(guān)結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組D3囊胚形成情況比較 經(jīng)序貫培養(yǎng)，優(yōu)質(zhì)胚胎組形成503枚囊胚，囊胚形成率為75.75%，非優(yōu)質(zhì)胚胎組形成139個(gè)囊胚，囊胚形成率為40.29%，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。優(yōu)質(zhì)胚胎組 D5、D6、D5+D6亞組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；優(yōu)質(zhì)胚胎組 D6、D5+D6亞組不可用囊胚形成率低于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

2.2 胚胎囊胚形成率的影響因素及種植率 與A組比較，B組、C組卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎構(gòu)成比、標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案構(gòu)成比、體外受精（IVF）構(gòu)成比、HCG日E2水平較高，而拮抗劑方案構(gòu)成比、卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）構(gòu)成比較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組胚胎種植率分別為 100.00%（1/1）、45.71%（16/35）、65.82%（104/158），其中C組胚胎種植率高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組其余指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2、3。

表1 2組D3囊胚形成情況比較[n（%）]

表2 胚胎囊胚形成率的影響因素

表3 胚胎級(jí)別對(duì)胚胎囊胚形成率的影響[%（n/n）]

2.3 胚胎囊胚形成速度的影響因素及種植率 與無囊胚形成亞組比較，D5、D6、D5+D6亞組卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎構(gòu)成比、HCG日E2水平較高，而卵裂期非優(yōu)質(zhì)胚胎構(gòu)成比、排卵障礙因素較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與無囊胚形成亞組比較，D6、D5+D6亞組標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案構(gòu)成比較高，拮抗劑方案構(gòu)成比較低，而D5亞組輸卵管因素構(gòu)成比較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D5、D6、D5+D6亞組胚胎種植率分別為78.26%（18/23）、53.19%（25/47）、62.60%（77/123），其中 D5亞組胚胎種植率高于D6亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4亞組其余指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、5。

3 討 論

隨著體外受精?胚胎移植技術(shù)的發(fā)展，為提高不孕不育患者的胚胎利用率及累積妊娠率，非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)成為移植冷凍后剩余非優(yōu)質(zhì)胚胎的主要處理對(duì)策[4]。本研究共收集1009個(gè)冷凍后剩余胚胎，經(jīng)序貫培養(yǎng)，優(yōu)質(zhì)胚胎總囊胚形成率為75.75%，非優(yōu)質(zhì)胚胎的總囊胚形成率為40.29%。卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎組的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，不可用囊胚形成率低于非優(yōu)質(zhì)胚胎組。卵裂期胚胎質(zhì)量不僅影響囊胚的形成率，也影響囊胚的質(zhì)量。一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，與發(fā)育至桑葚胚階段的胚胎比較，能發(fā)育至囊胚期的胚胎有較高的自我糾正率，說明隨著胚胎體外培養(yǎng)至囊胚期，其非整倍體和嵌合型胚胎有可能獲得修復(fù)，盡管非優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率低，但囊胚培養(yǎng)能夠有效地淘汰一部分發(fā)育潛能差或染色體有異常的胚胎[5]，體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)為非優(yōu)質(zhì)胚胎的自我選擇提供了機(jī)會(huì)，從非優(yōu)質(zhì)的卵裂期胚胎中選出發(fā)育潛能好的胚胎[6]。

表4 胚胎囊胚形成速度的影響因素

表5 胚胎級(jí)別對(duì)胚胎囊胚形成速度的影響[%（n/n）]

卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，形成囊胚的影響因素很多，尤其對(duì)實(shí)驗(yàn)室的體外培養(yǎng)體系有更高要求[3]。GLUJOVSKY等[7]分析顯示，囊胚移植在活產(chǎn)率方面優(yōu)于卵裂期胚胎移植，但囊胚移植組延長(zhǎng)的培養(yǎng)可能無囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累計(jì)妊娠率優(yōu)于囊胚移植，囊胚移植未顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。對(duì)于高齡等卵巢功能下降的患者，往往因獲卵數(shù)少、形成胚胎少，體外延長(zhǎng)培養(yǎng)對(duì)有無囊胚形成而取消周期的風(fēng)險(xiǎn)更高[8]。本研究結(jié)果顯示，無囊胚形成亞組中非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎構(gòu)成比例高，對(duì)于第3天卵裂胚數(shù)目少且級(jí)別低的周期，為避免移植周期取消不主張繼續(xù)養(yǎng)囊胚，采用卵裂期胚胎移植更為合適。

YI等[9]比較發(fā)現(xiàn)D5囊胚種植率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率明顯高于D5/D6組囊胚，認(rèn)為囊胚發(fā)育速度能夠影響囊胚移植的結(jié)局。而任新玲等[10]研究認(rèn)為，即使第6天發(fā)育至3期以上的囊胚，其復(fù)蘇后對(duì)妊娠結(jié)局也沒有影響，認(rèn)為囊胚的發(fā)育速度對(duì)妊娠結(jié)局無影響。本研究結(jié)果顯示，囊胚形成速度快，移植后臨床種植率也高，其發(fā)育速度反映了胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能。ALFARAWATI等[5]利用滋養(yǎng)層活檢對(duì)囊胚進(jìn)行非整倍體發(fā)生率時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)育延遲的囊胚非整倍體率顯著高于正常發(fā)育組。這也解釋了移植D5囊胚比D6囊胚可獲得更好的妊娠結(jié)局。在行凍融囊胚移植時(shí)既要考慮囊胚評(píng)級(jí)，同時(shí)還應(yīng)該參考胚齡。在復(fù)蘇周期中若有第5天囊胚和第6天囊胚可供選擇時(shí)，優(yōu)先選擇第5天囊胚進(jìn)行移植將獲得更好的臨床結(jié)局。

早期胚胎質(zhì)量的評(píng)估對(duì)其后續(xù)發(fā)育潛能具有十分重要的預(yù)測(cè)作用，本研究結(jié)果顯示，HCG日E2水平與囊胚形成有關(guān)，有囊胚形成組HCG日E2水平明顯高于無囊胚形成組。提示卵巢功能好、獲卵數(shù)多患者，最終形成囊胚率高。有研究表明，卵裂期胚胎移植后，剩余姐妹胚胎的囊胚形成率與其臨床妊娠率呈正相關(guān)，認(rèn)為移植卵裂胚可能與姐妹胚胎體外形成的囊胚具有相似的發(fā)育潛能[11]。不同促排卵方案根據(jù)自身特點(diǎn)不同，具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。囊胚形成率高的組別中，標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案構(gòu)成比高，拮抗劑方案構(gòu)成比低，卵裂期胚胎質(zhì)量本身是影響囊胚形成率的重要因素?？傮w囊胚形成率高的周期，授精方式中IVF授精比例更高，ICSI授精比例更低。IVF授精時(shí)卵周顆粒細(xì)胞對(duì)精子進(jìn)行了優(yōu)選，最后發(fā)生精卵結(jié)合的精子DNA完整性高。ICSI授精時(shí)選擇形態(tài)好的精子進(jìn)行注射，無法識(shí)別精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)是否存在異常[12]。研究表明，精子DNA碎片增多不影響卵母細(xì)胞授精，但可明顯降低其囊胚形成率。因此，相對(duì)于ICSI，常規(guī)IVF授精后的非優(yōu)質(zhì)胚胎具有更好的發(fā)育潛能。

綜上所述，對(duì)胚胎質(zhì)量的評(píng)估手段依然需要不斷完善，對(duì)形態(tài)學(xué)評(píng)估為低等級(jí)的胚胎不應(yīng)完全放棄，囊胚培養(yǎng)可幫助篩選出有發(fā)育潛能的胚胎，以提高胚胎的有效利用率和累計(jì)妊娠率。對(duì)于高齡、獲卵數(shù)少的患者，行低等級(jí)胚胎囊胚培養(yǎng)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，需謹(jǐn)慎。