羅 雪，彭建明，江秀玲（揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 225009）

木香烴內(nèi)酯是從中藥木香、月桂樹、荷花、玉蘭等植物中提取的主要化學(xué)成分，具有多種藥理學(xué)和生物化學(xué)活性[1]。研究表明，木香烴內(nèi)酯可降低血糖，能抑制機(jī)體對酒精的吸收，有抗炎、抑制微生物活性和抗腫瘤等多種藥理學(xué)功能[2?4]。然而關(guān)于木香烴內(nèi)酯在肺癌中作用的報道較少見。本研究以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為模型，分析了木香烴內(nèi)酯對肺癌細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。木香烴內(nèi)酯購自上海詩丹德生物公司，純度大于98%，用二甲基亞砜（DMSO）配置成200 mmol/L備用；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自AMRESO公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以下各實驗部分所用細(xì)胞均為對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞體外生長 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，加入不同濃度的木香烴內(nèi)酯（3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 和 100.000 μmol/L），分別為 a、b、c、d、e、f組，對照組加入0.1%DMSO，48 h后采用MTT法測定腫瘤細(xì)胞活性。每孔加入10 μL MTT，混勻后在37℃溫度下培養(yǎng)4 h，然后吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀測定在492 nm處的吸光度值（OD）。抑制率=（1-各劑量組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡比例 細(xì)胞與不同濃度藥物孵育48h后，收集細(xì)胞并用 10 μg/mL Annexin V?FITC 和 20 μg/mL PI進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例。

1.2.4 Bax mRNA和Bcl?2表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)木香烴內(nèi)酯處理后，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA），然后以cDNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl?2基因表達(dá)情況。內(nèi)參基因為甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH），引物如下：Bcl?2 上游引物為 5′?GGT CGC CAG GAC CTC GCC GC?3′，下游引物為 5′?AGT CGT CGC CGG CCT GGC G?3′；Bax 上游引物為 5′?GAG CTG CAG AGG ATG ATT GC?3′，下游引物為 5′?AGC CCA ACA GCC GCT CCC GG?3′；GAPDH 上游引物為 5′?GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT?3′，下游引物為 5′?GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG?3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以表示，組間比較采用One?way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 木香烴內(nèi)酯抗腫瘤細(xì)胞增殖 木香烴內(nèi)酯對肺癌細(xì)胞A549的生長具有顯著抑制效果，木香烴內(nèi)酯各劑量組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而且隨藥物劑量的不斷增加，其抑制效果更加顯著。見圖1。

圖1 木香烴內(nèi)酯處理后對肺癌細(xì)胞A549增殖作用

2.2 木香烴內(nèi)酯對肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響 d、e、f組經(jīng)木香烴內(nèi)酯處理肺癌細(xì)胞A54948 h后，其凋亡率分別為（6.90±0.32）%、（28.07±0.22）%和（46.92±0.44）%，與對照組的（2.51±0.28）%比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2。

2.3 木香烴內(nèi)酯對肺癌細(xì)胞A549 Bax和Bcl?2基因表達(dá)作用 與對照組比較，d、e、f組經(jīng)木香烴內(nèi)酯組細(xì)胞內(nèi)Bcl?2基因表達(dá)水平明顯下降，而Bax基因表達(dá)水平顯著升高，Bcl?2/Bax比值也明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3、4。

圖2 木香烴內(nèi)酯處理后對A549細(xì)胞凋亡作用

圖3 木香烴內(nèi)酯處理后對A549細(xì)胞基因表達(dá)作用

圖4 木香烴內(nèi)酯處理后對A549細(xì)胞Bax/Bcl-2比率的影響

3 討 論

近年來，越來越多的科研工作者專注于抗癌中草藥的研發(fā)。研究表明，木香烴內(nèi)酯具有比較廣泛的抗癌功能，對多種類型的惡性腫瘤如胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、白血病、肝癌和肺癌等都具有較好的抑制作用[4?7]。本文對木香烴內(nèi)酯抗人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯能有效地抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性死亡，最初表示在機(jī)體發(fā)育過程中一種具有典型形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞死亡方式，多種病理學(xué)因素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的失衡在某些腫瘤的病理過程中起著非常重要的作用。凋亡的主要特征有細(xì)胞皺縮、膜翻轉(zhuǎn)、DNA梯狀條帶等[8?10]。細(xì)胞凋亡是一個主動由基因調(diào)控的生物學(xué)過程，因此能夠通過開發(fā)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的藥物來掌控細(xì)胞凋亡，Bcl?2家族蛋白便是其中的典型代表[11]。Bcl?2 家族主要分為兩類：抑制凋亡蛋白（如 Mcl?1和 Bcl?2 等）和誘導(dǎo)凋亡蛋白（如 Bax和 Bad 等）[12?13]。有研究顯示，Bcl?2蛋白能夠抑制線粒體膜間隙分子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，表明Bcl?2在線粒體凋亡通路中起了重要作用[12]。此外，Bcl?2還被發(fā)現(xiàn)能夠影響細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流。凋亡誘導(dǎo)信號能夠誘導(dǎo)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放，線粒體中鈣離子過載后導(dǎo)致線粒體基質(zhì)膨大，進(jìn)而引起線粒體膜電位失勢，而Bcl?2能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放，使細(xì)胞對凋亡不敏感，而Bax的作用則相反，能夠增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放[9，12?13]。本研究結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯通過抑制Bcl?2表達(dá)和促進(jìn)Bax表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞增殖的目的，提示Bcl?2和Bax參與木香烴內(nèi)酯介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。有研究顯示，細(xì)胞凋亡過程中存在促凋亡蛋白Bax的增加和抑制凋亡蛋白 Bcl?2 的降低[8?10]。因此，Bcl?2/Bax 是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)木香烴內(nèi)酯處理后，肺癌細(xì)胞內(nèi)Bcl?2/Bax比值顯著下降。

綜上所述，木香烴內(nèi)酯能顯著抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖，并促進(jìn)該細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過降低Bcl?2表達(dá)，升高Bax表達(dá)，從而誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生凋亡。