李 強(qiáng)，鄧 君（.成都航天醫(yī)院檢驗科，四川成都60000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗科，成都60000）

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，對其易感基因的研究越來越受到人們重視，目前發(fā)現(xiàn)了多種基因表達(dá)異常與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)，如人乳房珠蛋白（hMAM）基因[1]、myc基因[2]、HER?2 基因[3]和乳腺癌易感基因?1（BRCA?1）[4]等。近年來，有文獻(xiàn)報道，同型半胱氨酸（Hcy）與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性，是晚期乳腺癌獨立危險因子[5?7]。但Hcy與乳腺癌相關(guān)基因聯(lián)合檢測在診斷中的應(yīng)用研究尚少見。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ?PCR）法，檢測乳腺癌患者外周血中hMAM、BRCA?1和myc基因表達(dá)量，同時采用循環(huán)酶法檢測Hcy水平，探討聯(lián)合檢測對乳腺癌診斷應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年6月成都航天醫(yī)院門診和住院乳腺疾病患者165例，按疾病嚴(yán)重程度分為良性乳腺病組（58例）和乳腺癌組（107例）。良性乳腺病組：年齡18～67歲；脂肪瘤27例，纖維瘤31例。乳腺癌組：年齡25～79歲；浸潤性導(dǎo)管癌40例，乳腺單純癌38例，不典型髓樣癌8例，黏液癌21例；臨床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期13例。所有患者經(jīng)明確病理學(xué)診斷確診。同時選取健康體檢女性40例作為對照組，年齡20～71歲。3組年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.1.2 試劑和儀器 Hcy檢測采用奧林巴斯680全自動生化分析儀，F(xiàn)Q?PCR Light Cycle熒光實時定量PCR儀購自瑞士Roche公司，F(xiàn)Q?PCR、反轉(zhuǎn)錄和內(nèi)對照試劑盒均購自邁克生物技術(shù)有限公司。在7700序列檢測分析儀上測定標(biāo)準(zhǔn)品和hMAM、myc和BRCA?1和GAPDH含量。引物和探針由華美生物工程公司合成。

1.2 方法 取靜脈晨血5 mL，1 mg/mL乙二胺四乙酸抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。利用Trizol液提取總RNA，進(jìn)行凝膠電泳鑒定。采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶體系對提取的總RNA進(jìn)行RT?PCR，42℃55 min。FQ?PCR 引物各 400 nmol/L，cDNA 5 μL，TaqDNA聚合酶 1.25 U，探針 150 nmol/L，10×緩沖液 5 μL，脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸和脫氧胞嘧啶核苷三磷酸各 200 μmol/L，尿嘧啶脫氧核苷三磷酸 400 μmol/L，二氯化鎂5 mmol/L，尿嘧啶N?糖基化酶0.5 U。反應(yīng)條件：50℃ 120 s，95℃10 min；再 94℃ 30 s，66 ℃ 60 s，42個循環(huán)。應(yīng)用2?ΔΔCt方法計算目的基因相對表達(dá)量，健康人組基因相對表達(dá)量為 1.011±0.083，以 2?ΔΔCt＞2 判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA?1和myc基因檢測結(jié)果比較 良性乳腺病組Hcy水平和hMAM、BRCA?1、myc基因表達(dá)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；乳腺癌組BRCA?1基因表達(dá)顯著低于對照組和良性乳腺病組，而Hcy水平和hMAM、myc基因表達(dá)均顯著高于對照組和良性乳腺病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因檢測結(jié)果比較（±s）

表1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因檢測結(jié)果比較（±s）

注：與對照組比較，aP＞0.05；與乳腺癌組比較，bP＜0.05

組別對照組良性乳腺病組乳腺癌組Hcy（μmol/L）9.22±2.54b 10.17±2.73ab 23.21±8.65 BRCA-1（×10-3）0.97±0.11b 0.94±0.15ab 0.35±0.04 myc（×10-3）1.45±0.13b 1.39±0.09ab 3.97±0.51 hMAM（×10-3）2.05±0.19b 1.95±0.06ab 6.88±0.74

2.2 Hcy和hMAM、BRCA?1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結(jié)果比較 在乳腺癌組中，Ⅲ+Ⅳ期患者Hcy水平和hMAM、myc基因表達(dá)均顯著高于Ⅰ+Ⅱ期，而BRCA?1基因表達(dá)顯著低于Ⅰ+Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結(jié)果（±s）

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結(jié)果（±s）

n分期I+II期Ⅲ+Ⅳ期6542 myc（×10-3）2.81±0.455.32±0.87 hMAM（×10-3）4.72±0.637.91±1.02 BRCA-1（×10-3）0.45±0.070.23±0.01 Hcy（μmol/L）19.36±5.0228.36±11.26

2.3 Hcy和 hMAM、BRCA?1、myc基因?qū)θ橄侔┰\斷性能 Hcy和hMAM、BRCA?1、myc基因聯(lián)合檢測乳腺癌的靈敏度和陰性預(yù)測值均顯著高于單個指標(biāo)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因?qū)θ橄侔┰\斷性能

3 討 論

BRCA?1、hMAM和myc均是近年來研究得較多的乳腺癌相關(guān)基因，其中BRCA?1是抑癌基因，也是乳腺癌最強(qiáng)易感基因之一，其變異攜帶者乳腺癌發(fā)病率高達(dá)60%～80%，歐美國家已將其列為遺傳高風(fēng)險人群篩查項目。BRCA?1在細(xì)胞生長、凋亡中起著關(guān)鍵作用，參與DNA損傷修復(fù)，當(dāng)發(fā)生突變時，基因組穩(wěn)定性遭到破壞，蛋白質(zhì)表達(dá)功能下降，導(dǎo)致細(xì)胞惡變和增殖[8?9]。myc基因?qū)儆诤说鞍最愓{(diào)控基因，編碼細(xì)胞增殖、分化和凋亡等轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌的擴(kuò)增率約占30%，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)[10?11]，可輔助預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)和生存期。hMAM是1996年WATSON等發(fā)現(xiàn)并證實只在乳腺組織中表達(dá)的乳腺癌相關(guān)蛋白，具有極高組織特異性，其異常表達(dá)與乳腺癌的微轉(zhuǎn)移和療效密切相關(guān)[12?13]。

Hcy屬于含硫氨基酸，高Hcy血癥一直以來都是冠狀動脈硬化的預(yù)測因子。近年來，有研究表明，Hcy可能還是乳腺癌的一個危險因素：一方面，大多數(shù)乳腺癌患者缺乏維生素B12和葉酸，引起蛋氨酸代謝障礙，導(dǎo)致Hcy水平持續(xù)性升高；另一方面，高Hcy誘導(dǎo)DNA損傷，造成遺傳不穩(wěn)定性，易導(dǎo)致乳腺癌，同時高Hcy可損傷內(nèi)皮激活血小板，破壞凝血、抗凝血和纖溶系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14?15]。目前，Hcy與乳腺癌相關(guān)基因的方法學(xué)比較文獻(xiàn)及聯(lián)合檢測對乳腺癌臨床診斷價值的報道較少見。

本研究采用循環(huán)酶法檢測Hcy，F(xiàn)Q?PCR法測定BRCA?1、hMAM和myc基因表達(dá)量，結(jié)果顯示，對照組Hcy水平和hMAM、BRCA?1、myc基因表達(dá)差異與良性乳腺病組均無顯著差異；乳腺癌組的BRCA?1基因表達(dá)顯著低于其他2組，而Hcy水平和hMAM、myc基因表達(dá)則顯著高于其他2組；在乳腺癌患者中，隨著臨床分期的增加，Hcy水平和hMAM、myc基因表達(dá)遞增，而BRCA?1基因表達(dá)遞減；4個指標(biāo)聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均顯著高于單個指標(biāo)。

綜上所述，Hcy對乳腺癌的輔助診斷具有一定的臨床意義，若能結(jié)合相關(guān)基因的檢測，可明顯提高對乳腺癌診斷的檢出率。但是，基層醫(yī)院可能缺乏基因檢測的儀器，當(dāng)Hcy水平異常升高時，在排除冠狀動脈硬化等心血管疾病時，應(yīng)考慮到乳腺癌的可能，可結(jié)合臨床進(jìn)一步確診。