陳曉迎，張 丹，姜麗萍，羅 麗，古妮娜，劉景侖（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診/重癥醫(yī)學(xué)科，重慶400016）

嗜鉻粒蛋白家族的多種激素前蛋白與兒茶酚胺共同儲(chǔ)存于嗜鉻粒細(xì)胞的分泌小泡中，在交感興奮和應(yīng)激情況下共同分泌進(jìn)入血液和周?chē)M織，嗜鉻粒蛋白A（CHGA）是這個(gè)家族中含量最豐富、功能最重要的成員之一。CHGA由8個(gè)外顯子編碼的439個(gè)氨基酸組成，其基因位于人類(lèi)染色體14q32。有研究顯示，CHGA基因上存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)[1]。

CHGA在體內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解為多個(gè)多肽片段，能夠發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，其中第7外顯子負(fù)責(zé)編碼CHGA 252～412氨基酸序列。目前，已知CHGA第7外顯子基因編碼區(qū)存在4個(gè)較為重要的SNP位點(diǎn)，參與新型心血管活性肽，如兒茶酚抑素（CHGA352～372，CST）、Prochromacin（CHGA79～431）、胰抑素（CHGA254～301）和旁腺抑素（CHGA351～431）等多肽片段的序列形成。CST 是目前研究最多的CHGA衍生多肽，可調(diào)解兒茶酚胺的分泌，具有多種與心血管生理作用相關(guān)的生物學(xué)活性。CST由21個(gè)氨基酸組成，為帶有正電荷的疏水性蛋白，其野生型氨基酸序列為SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL。已有研究表明，人類(lèi)CST有3種具有不同活性的亞型：Gly364Ser、Pro370Leu 和 Arg374Gln，分別由 rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）和 rs9658669（A/G）3個(gè) SNP 位點(diǎn)控制，其中以Gly364Ser亞型最為多見(jiàn)[2]。研究顯示，CST多態(tài)性與高血壓等疾病的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，越來(lái)越受到人們的重視[3-4]。另外，位于CHGA第7外顯子的SNP位點(diǎn)rs729940（T/C）編碼氨基酸Trp381Arg，參與CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素的一級(jí)結(jié)構(gòu)組成，存在較高的突變率，該位點(diǎn)的突變對(duì)這些多肽片段功能影響的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

第7編碼區(qū)的以上4個(gè)SNP位點(diǎn)均位于CHGA重要功能區(qū)，其在重慶地區(qū)漢族人群中的基因型分布特點(diǎn)還未有研究。鑒于CHGA功能的重要性和基因多態(tài)性對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的顯著影響，了解我國(guó)不同地區(qū)和群體CHGA的相關(guān)基因多態(tài)性的特征顯得非常有必要。本研究以重慶地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的漢族人群作為調(diào)查對(duì)象，旨在闡明CHGA第7外顯子的主要SNP等位基因分布情況，并為進(jìn)一步研究CHGA的基因多態(tài)性與高血壓等疾病的易感性、發(fā)病機(jī)制和藥物療效等相關(guān)性提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2012年7月至2013年1月本院體檢健康者218例，年齡18～40歲，血壓均正常，均為漢族。其他地區(qū)數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心。

1.1.2 主要試劑 全血總DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，DNA Taq酶、DNA 1000標(biāo)記物及引物均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，Primer 5設(shè)計(jì)引物序列：上游為 5′-AGG GAA GGG AGA ACA G-3′，下游為5′-CGT TGT CCA GAA GGC AGT AGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集及DNA提取 根據(jù)知情同意的原則，采集受試者外周靜脈血2 mL，嚴(yán)格按照全血基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求方法提取DNA，并儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增及產(chǎn)物基因型鑒定應(yīng)用上述引物和DNA樣本進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為25 mL，反應(yīng)條件：94℃4 min預(yù)變性，94℃變性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 45 s，共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。目的片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由上海美吉生物公司進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行對(duì)應(yīng)位點(diǎn)基因型鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)CHGA第7外顯子4個(gè)SNP位點(diǎn)最小等位基因頻率（MAF），進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行基因型分布的計(jì)算分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取及目的片段擴(kuò)增 采用萃取柱血液DNA提取試劑盒提取外周靜脈血DNA濃度可達(dá)到25～30 ng/mL，擴(kuò)增后產(chǎn)物為658 bp，CHGA第7外顯子目的片段電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 CHGA第7外顯子目的片段電泳圖

2.2 CHGA第7外顯子SNP位點(diǎn)基因型鑒定 目的片段測(cè)序后對(duì) rs9658667、rs9658668、rs9658669 和 rs729940共4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因型鑒定。rs9658667位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)2種基因型：野生型GG和突變雜合子GA型，見(jiàn)圖2。rs9658668、rs9658669 位點(diǎn)僅發(fā)現(xiàn)野生型 CC、GG，未發(fā)現(xiàn)突變型。rs729940共發(fā)現(xiàn)3種基因型：野生型CC型、突變雜合子CT型和突變純合子TT型，見(jiàn)圖3。

圖2 rs9658667位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果及基因型分析

圖3 rs729940位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果及基因型分析

2.3 CHGA第7外顯子SNP位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型分布 218例漢族人群中，rs9658667位點(diǎn)GG基因型197例，GA基因型21例，AA基因型0例，MAF為0.0481；rs9658668位點(diǎn)CC基因型218例，CT基因型和TT基因型均為0例，MAF為0；rs9658669位點(diǎn)GG基因型218例，GA基因型和AA基因型均為0例，MAF為0；rs729940位點(diǎn)CC基因型144例，CT基因型67例，TT基因型7例，MAF為0.1857。該基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.954），可認(rèn)為該樣本具有人群代表性。見(jiàn)表1。

表1 CHGA第7外顯子SNP位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型分布

2.4 不同地區(qū)人群CHGA第7外顯子SNP的分布情況比較 重慶地區(qū)人群rs9658667位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于肯尼亞人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），而與北京地區(qū)、意大利人群比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.185、0.117）；北京地區(qū)人群A等位基因頻率顯著高于意大利人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。重慶地區(qū)人群rs9658668位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變型；在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，亞洲、歐洲人群均未見(jiàn)突變型，非洲人群T等位基因頻率為0.018。重慶地區(qū)人群rs9658669位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變型；在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，亞洲、非洲人群均未見(jiàn)突變型，歐洲人群A等位基因頻率為0.010。重慶、北京地區(qū)人群rs729940位點(diǎn)T等位基因頻率明顯高于尼日利亞人群，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000）。見(jiàn)表 2、3。

表2 不同地區(qū)人群rs9658667位點(diǎn)多態(tài)性分布

表3 不同地區(qū)人群rs729940位點(diǎn)多態(tài)性分布

3 討 論

CHGA具有調(diào)節(jié)兒茶酚胺釋放、抑制胰島素和甲狀旁腺激素分泌、抗菌及舒張血管等多種生物學(xué)活性，參與調(diào)節(jié)機(jī)體交感和應(yīng)激功能，對(duì)心血管疾病、精神疾病及膿毒癥等疾病的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸有著一定影響。有研究表明，血清CHGA的水平與高血壓的發(fā)病率及遠(yuǎn)期預(yù)后、膿毒癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5-6]。

CHGA基因序列中存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，位于編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列，進(jìn)而影響CHGA衍生片段的結(jié)構(gòu)和功能，其中位于第7外顯子編碼序列上存在4個(gè)非同義SNP位點(diǎn)，分別改變了CST、Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素4個(gè)衍生多肽的氨基酸編碼。由于種族和地區(qū)遺傳環(huán)境差異，人類(lèi)SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布往往不同，我國(guó)僅在人類(lèi)基因組計(jì)劃中對(duì)88例北京地區(qū)人群進(jìn)行了小樣本的部分位點(diǎn)研究。本研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)人群rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）、rs9658669（A/G）和 rs729940（T/C）4 個(gè)位點(diǎn)的MAF 分別為：0.048、0.000、0.000和 0.186。在與 CST 序列相關(guān)的3個(gè)SNP位點(diǎn)中，重慶地區(qū)人群rs9658667（Gly364Ser）位點(diǎn)突變率顯著高于肯尼亞人群，而與北京地區(qū)、意大利人群比較無(wú)顯著差異；北京地區(qū)人群突變率顯著高于意大利人群；rs9658668（Pro370Leu）和rs9658669（Arg374Gln）兩位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變，與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中亞洲人群（北京地區(qū)、印度）在該位點(diǎn)無(wú)突變的情況相符合。

CHGA衍生片段CST是一種心血管保護(hù)活性肽，與多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)：（1）CST具有抑制高血壓發(fā)生的作用，可負(fù)反饋抑制嗜鉻粒細(xì)胞脫顆粒而減少兒茶酚胺釋放，維持自主神經(jīng)系統(tǒng)正常功能[7]；（2）CST參與缺血性心臟病的發(fā)生，可通過(guò)促進(jìn)心臟側(cè)支循環(huán)建立，抑制心肌細(xì)胞凋亡，拮抗心肌缺血再灌注損傷[8]；（3）CST與充血性心力衰竭發(fā)生有關(guān)，既能夠直接激動(dòng)心肌β受體，又可拮抗異丙腎上腺素的收縮冠狀動(dòng)脈和正性肌力等作用[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心血管疾病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，其中遺傳因素的貢獻(xiàn)作用占20%～55%[10]。CST的以上3個(gè)SNP位點(diǎn)被認(rèn)為是原發(fā)高血壓等心血管疾病的易感基因。RAO 等[11]研究表明，rs9658667（Gly364Ser）位點(diǎn)突變后會(huì)改變?nèi)祟?lèi)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)神經(jīng)的自律性，可能會(huì)降低高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)于男性。BISWAS[12]研究表明，黑種人群體 rs9658668（Pro370Leu）位點(diǎn)突變率比其他種族高，且該突變型群體高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高，因而該基因型可能與黑人高血壓發(fā)病相關(guān)。CST的Pro370Leu突變型抑制兒茶酚胺釋放作用最強(qiáng)，野生型次之，Arg374Gln突變型作用最弱[13]。除此之外，不同亞型還對(duì)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞抗腎上腺素能效應(yīng)、一氧化氮的釋放、缺血再灌注等產(chǎn)生不同影響[8]。因此，遺傳基礎(chǔ)的不同導(dǎo)致CST結(jié)構(gòu)及功能差異，進(jìn)而可能導(dǎo)致與CST密切相關(guān)的疾病發(fā)生及轉(zhuǎn)歸不同。rs9658667（Gly364Ser）位點(diǎn)的多態(tài)性分布差異是否對(duì)重慶地區(qū)高血壓等心血管疾病的發(fā)病率產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，CHGA第7外顯子上的另外一個(gè)SNP位點(diǎn)rs729940（Trp381Arg）的突變率較高，且與尼日利亞人群顯著不同，該位點(diǎn)參與CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。至今為止，尚缺乏該位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)衍生片段功能產(chǎn)生影響的證據(jù)，但I(xiàn)IJIMA等[14]的研究已表明，該位點(diǎn)與CHGA啟動(dòng)子rs9658635位點(diǎn)組成的單體型與日本人精神分裂癥的發(fā)病顯著相關(guān)，其具體機(jī)制尚不清楚。因此，該位點(diǎn)變異對(duì)CHGA衍生片段功能的影響，以及在漢族人群中與精神分裂癥等相關(guān)疾病的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，rs9658667、rs729940位點(diǎn)等位基因頻率具有一定種族地區(qū)差異，而rs9658668、rs9658669位點(diǎn)無(wú)突變。本研究提供了重慶地區(qū)健康漢族人群CHGA第7外顯子基因多態(tài)性的分布規(guī)律，為進(jìn)一步進(jìn)行該基因多態(tài)性與高血壓等疾病的關(guān)聯(lián)研究提供了重要的流行病學(xué)基礎(chǔ)資料。