劉潔 曾燁 周玨宇 陳志超 張漢榮 賴姝彧 吳小麗 譚令梅 王雪飛

[摘要] 目的 探討miR-519d對人宮頸癌細胞中CDKN1A/p21基因的靶向調(diào)控作用以及對細胞增殖、周期的影響。方法 通過熒光定量PCR技術檢測miR-519d抑制物對其活性的調(diào)控作用。在宮頸癌HeLa和SiHa細胞中下調(diào)miR-519d表達，利用MTT法檢測細胞增殖能力，通過流式細胞術檢測細胞周期的分布情況。將miR-519d mimic轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細胞，用熒光定量PCR、Western Blot分別檢測p21 mRNA和蛋白水平的表達。利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確認miR-519d與p21的靶向關系。 結(jié)果 miR-519d抑制物能有效下調(diào)宮頸癌HeLa和SiHa細胞內(nèi)miR-519d的表達。MTT實驗和細胞周期分析結(jié)果提示，下調(diào)細胞內(nèi)miR-519d的表達能夠顯著降低細胞增殖活力，并使細胞周期阻滯于G1期。進一步通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)鑒定miR-519d能夠結(jié)合p21 mRNA 3′UTR有效抑制其表達。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，過表達miR-519d能在mRNA和蛋白水平上抑制p21的表達。 結(jié)論 p21是miR-519d的直接靶基因，miR-519d可能通過靶向p21調(diào)控宮頸癌細胞增殖。

[關鍵詞] 微小RNA；宮頸癌；p21；細胞周期

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）21-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-519d in the targeted regulation of CDKN1A/p21 gene in human cervical cancer cells and its effect on cell proliferation and cell cycle. Methods The effect of miR-519d inhibitor on its activity was detected by fluorescence quantitative PCR. The miR-519d expressions in cervical cancer cell HeLa and SiHa were down-regulated. The cell proliferation abilitywas detected by MTT assay， and cell cycle distribution was detected by flow cytometry. MiR-519d mimic was transfected into HeLa and SiHa cells， and the expression of p21 mRNA and protein was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot， respectively. A dual luciferase reporter gene system was used to confirm the targeting relationship between miR-519d and p21. Results The miR-519d inhibitor can effectively down-regulate the expression of miR-519d in HeLa and SiHa cells of cervical cancer. The results of MTT assay and cell cycle analysis suggested that the down-regulation of miR-519d expression in cells could significantly reduce cell proliferation and arrest cell cycle at G1 phase. Further the dual luciferase reporter system identified that miR-519d was able to in combination with p21 mRNA 3'UTR and effectively inhibit the expression of p21. The results of qRT-PCR and Western blot showed that overexpression of miR-519d inhibited the expression of p21 at mRNA and protein levels. Conclusion p21 is a direct target gene of miR-519d， and miR-519d may regulate the proliferation of cervical cancer cells by targeting p21.

[Key words] MicroRNA； Cervical cancer； p21； Cell cycle

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種大小約21～25個堿基的單鏈小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，它可以通過與特定mRNA結(jié)合或調(diào)控特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯而影響基因表達。近年來，大量研究表明miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色。miR-519d是我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)的一個與細胞周期調(diào)控有關的RNA分子[1]，其定位于第19號染色體19q13.41區(qū)，是人體內(nèi)最大的miRNA基因簇C19MC所在位置，最早發(fā)現(xiàn)它能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體，引起脂肪酸代謝紊亂，與肥胖相關[2]。最近研究表明，miR-519d參與調(diào)控肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等[3-7]腫瘤中發(fā)生發(fā)展，與其診斷和預后有關。然而，它在宮頸癌進展中究竟扮演何種角色及其具體機制，仍有待闡明。本研究中，我們利用miR-519d inhibitor干擾宮頸癌SiHa和HeLa細胞內(nèi)miR-519d的表達，利用MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期分布，綜合表達譜芯片數(shù)據(jù)和生物信息學預測結(jié)果，明確靶基因CDKN1A/p21，以揭示miR-519d促進宮頸癌增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（高糖）、Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000、Superscrpt Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒均購自美國Invitrogen公司，RNeasy mini試劑盒購自德國Qiagen公司，Trizol試劑、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、psi-CHECK-2質(zhì)粒DNA購自美國Promega公司。miR-519d模擬物mimic、抑制物inhibitor以及NC均由上海吉瑪公司設計合成。熒光定量PCR引物由華大基因合成。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）等購自Sigma公司。細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司。p21、GAPDH蛋白抗體購自Abcam公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱購自上海Thermo Fisher公司，ND-1000紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自美國NanoDrop公司，ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，GloMax生物發(fā)光檢測儀購自美國Promega公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞購自美國BD公司，SDS-PAGE垂直電泳槽、酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HeLa、SiHa細胞均培養(yǎng)于含有10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程如下：將小分子RNA（inhibitor/mimic或NC）稀釋于200 μL Opti-MEM中，輕敲管壁混勻；每管加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，輕敲管壁混勻，室溫放置20 min，將RNA/Lipofectamin復合物加入2 mL的細胞稀釋液，混勻后加入細胞培養(yǎng)板，根據(jù)需要于轉(zhuǎn)染后不同時間點收集細胞。以上宮頸癌HeLa、SiHa細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 總RNA提取及熒光定量PCR

收集實驗組（轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitor/mimic）和陰性對照組（Negative control，NC）細胞，根據(jù)Trizol試劑說明書進行總RNA的提取，隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進行cDNA的合成，分別用U6和GAPDH為內(nèi)參進行qRT-PCR，檢測miR-519d及p21的表達情況，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

1.5 MTT實驗

先將細胞培養(yǎng)在96個孔中，每個孔中放入3000個細胞，隨后miR-519d inhibitor/NC轉(zhuǎn)染HeLa或SiHa細胞，于轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h，在每孔中加入20 μL的MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后置于酶標儀上測定490 nm波長時每孔的吸光度A值以反映細胞生長活力。

1.6細胞周期檢測

轉(zhuǎn)染48 h后收集各組HeLa和SiHa細胞，用預冷的75%乙醇混勻4℃固定過夜，離心收集細胞，用200 μL的PBS重懸細胞并避光用PI孵育20 min，經(jīng)BD FACSCalibur流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化。

1.7 Western blot實驗

48 h后收集各組轉(zhuǎn)染后HeLa和SiHa細胞，用RIPA細胞裂解液提取各組細胞中總蛋白，BCA法進行蛋白定量。每組上樣30 μg總蛋白經(jīng)行10%的SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h，加入p21一抗，4℃孵育p21和GAPDH一抗過夜，加入二抗，室溫孵育l h，洗滌后ECL化學發(fā)光顯影，曝光掃描拍照。用Quantity One軟件分析各組轉(zhuǎn)染后細胞中p21蛋白相對表達情況。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

通過上述Targetscan網(wǎng)站預測的miR-519d與候選靶基因p21的3′ UTR的結(jié)合部位，將野生型和突變型3′ UTR序列分別插入雙光素酶報告基因質(zhì)粒 psi-CHECK-2中，從而獲得野生型（wt）和突變型（mt）的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，并經(jīng)測序鑒定。隨后，將野生型或突變型質(zhì)粒分別與miR-519d mimic或NC共轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細胞。待轉(zhuǎn)染48 h后收集且裂解細胞，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測試劑盒測定Renilla luciferase與firefly luciferase的活性，并計算各組中兩者的比值。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析或t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-519d抑制物對宮頸癌細胞內(nèi)miR-519d表達水平的影響

前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-519d的表達在宮頸癌臨床組織標本中高表達。因此，本項目擬采用miR-519d抑制物下調(diào)其活性以觀察其對細胞增殖、細胞周期的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組相比，宮頸癌HeLa和SiHa細胞中miR-519d抑制物能顯著降低其表達，可作為后續(xù)活性調(diào)控的有效方法（P<0.05），見圖1。

2.2下調(diào)miR-519d活性對于宮頸癌細胞增殖能力的影響

MTT法檢測轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitor對于宮頸癌細胞HeLa和SiHa增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細胞后能夠降低細胞生長活力（圖2）。與NC組相比，轉(zhuǎn)染后24～96 h時段內(nèi)，miR-519d inhibitor能顯著降低HeLa及SiHa細胞的生長活力，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

2.3 下調(diào)miR-519d活性對于宮頸癌細胞周期的影響

流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細胞后能阻滯細胞周期進程。如圖3所示，與NC組相比，miR-519d inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa和SiHa細胞后，G1期比例明顯升高，而S期細胞比例顯著下降（P<0.05），而G2/M期無明顯差異，說明下調(diào)miR-519d的活性可能通過影響細胞周期G1/S監(jiān)測點而發(fā)揮作用。

2.4 p21是miR-519d的直接靶基因

為了進一步探討miR-519d影響宮頸癌細胞增殖、周期的具體機制，采用Targetscan等生物信息學軟件預測其靶基因，發(fā)現(xiàn)p21與細胞周期調(diào)控相關，并根據(jù)結(jié)合位點設計雙熒光素酶報告質(zhì)粒的插入序列（圖4a）。熒光素酶報告實驗結(jié)果提示，與NC組相比，HeLa和SiHa細胞中，miR-519d mimic可顯著抑制p21野生型3′ UTR的熒光素酶活性，而對種子序列突變型3′ UTR的熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用（圖4b）。此外，宮頸癌細胞HeLa及SiHa中上調(diào)miR-519d的表達對p21的mRNA及蛋白水平均起到負性調(diào)控作用（圖4c、d）。上述結(jié)果證明了miR-519d能夠靶向作用于p21，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達，從而促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

3討論

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。高危人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素。研究表明，HR-HPV表達的癌蛋白E6和E7，能分別結(jié)合并降解宿主細胞p53和RB家族蛋白，并通過一系列分子改變，引起細胞周期、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為改變，促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導致宮頸癌發(fā)生與進展。然而，單純的HPV感染并不足以誘導宮頸癌的發(fā)生，提示必然有其他未知因素的協(xié)同作用[8]。

近年來，隨著miRNA功能研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，其在宮頸癌中扮演著重要的角色，在腫瘤診斷、復發(fā)、預后評價中具有廣闊的應用前景，有望成為宮頸癌診斷、預后評價的新型標志物以及臨床治療的新靶點。前期的研究中，我們在HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)miR-519d的表達水平具有周期性，很可能與細胞周期調(diào)控有關[1]。采用Targetscan軟件分析其序列發(fā)現(xiàn)，miR-106a/106b/17/20a/20b/93/519d具有相同的seed序列（AAAGUGC），說明它們可能具有相似的功能。而miR-106b家族（miR-106a/106b/17-5p/20a/20b）能夠靶向p21加速細胞通過G1/S關卡，發(fā)揮類似癌基因的功能[9]。此外，28種靶向p21的miRNAs中恰好包含上述miR-106b家族和miR-519d，且在絨癌JAR細胞中下調(diào)miR-519d可顯著抑制細胞生長，并將細胞阻滯于G1期[10]。Lehmann等[3]發(fā)現(xiàn)，與男性乳房增生癥患者相比，男性乳腺癌患者中miR-519d的表達明顯升高。然而，Deng等[11]關于其在乳腺癌中的作用恰恰相反。同樣地，對于肝癌中miR-519d的功能研究亦存在爭議，如Hou等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-519d能靶向MKi67在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，而Fornari等[5]發(fā)現(xiàn)miR-519d在肝癌組織中高表達，能通過靶向p21、PTEN、AKT3、TIMP2而促進肝癌細胞的增殖、侵襲，抑制抗癌藥物誘導的細胞凋亡的功能。但近期Fornari等[12]再次報道循環(huán)血液中miR-519d的表達隨著肝硬化向早期肝癌、進展期肝癌的演進過程中逐步升高，這可能涉及miR-519d的胞外分泌機制。此外，miR-519d還能通過抑制TGF-β信號通路而促進肺癌A549細胞增殖[6]。Yue等[13]、Yang等[14]、Xie等[15]和Bai等[16]分別報道m(xù)iR-519d在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及肺腺癌中具有抑癌基因的功能，但Hua等[17]報道m(xù)iR-519d能促進黑色素瘤的進展，發(fā)揮癌基因的功能。上述研究充分說明，miR-519d的作用機制可能涉及細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡等信號通路，關于miR-519d在腫瘤中究竟扮演何種角色，可能涉及組織特異性的問題，相關領域值得進一步關注，其具體的分子機制仍需進一步探討。

本研究證實miR-519d對宮頸癌細胞的生長增殖、周期具有明顯的調(diào)控作用后，利用生物信息學軟件預測到miR-519d的作用靶點，結(jié)合前期miR-519d的表達譜芯片數(shù)據(jù)，從中篩選到p21可能是其潛在靶基因，并對miR-519d靶向p21影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用機制展開了初步研究。p21是細胞周期的負性調(diào)控因子，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinases inhibitors，CDKIs）家族中的重要成員。它既與腫瘤抑制作用密切相關，又能通過抑制周期蛋白依賴性激酶復合物的活性，協(xié)調(diào)細胞周期、DNA復制與修復之間的關系，從而將腫瘤抑制作用與細胞周期控制過程緊密相連。通過抑制cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2的活性，使Rb蛋白不能磷酸化，E2F不能釋放，而使細胞周期停滯在G1期。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細胞中，上調(diào)miR-519d后，p21蛋白的表達水平顯著降低；下調(diào)miR-519d的表達可抑制細胞增殖，并將細胞周期阻滯在G1期。

綜上所述，miR-519d可通過靶向p21基因，調(diào)控其蛋白表達水平，進而可能影響宮頸癌細胞增殖及細胞周期等生物學行為，研究結(jié)果為進一步完善宮頸癌的發(fā)病機制提供重要的實驗依據(jù)，也為宮頸癌的靶向治療提供新的線索。此外，患者循環(huán)血液中miR-519d的表達水平也是今后值得關注的一個研究內(nèi)容。

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（收稿日期：2017-11-01）