王菲迪，張海軍，耿檸波，任曉倩,3，張保琴，宮玉峰，陳吉平,*

1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023 2. 省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

近年來，環(huán)境污染受到越來越廣泛的關(guān)注，且環(huán)境化學(xué)污染物種類繁多，往往多以低濃度混合物形式存在，因此不可避免地對人類造成復(fù)雜多樣的健康危害，即潛在聯(lián)合毒性效應(yīng)。因此環(huán)境污染物的低劑量、聯(lián)合毒性效應(yīng)已經(jīng)成為毒理學(xué)研究中的熱點問題。具有相似或者不同作用機制的化學(xué)污染物能夠互相影響各自的毒性效應(yīng)，從而可能在不同的生物反應(yīng)指標和多個作用終點引起一系列的協(xié)同、加和或者拮抗效應(yīng)[1-2]。多環(huán)芳烴(PAHs)和短鏈氯化石蠟(SCCPs)是2種典型的有機污染物。PAHs是一類由2個或2個以上苯環(huán)構(gòu)成的碳氫化合物，約有200多種，主要來源于有機質(zhì)的熱解和不完全燃燒[3]。短鏈氯化石蠟(short-chain chlorinated paraffins, SCCPs)是鏈長為10～13個碳原子，氯化程度在30%～70%的氯化石蠟，于2017年列入斯德哥爾摩公約POPs行列[4]。

PAHs和SCCPs廣泛存在于各種環(huán)境介質(zhì)中，在人母乳和血液中都以較高的濃度水平存在。SCCPs在中國人母乳和血液中濃度分別為5.24～644 μg·L-1[5]和14.8～1 400 μg·L-1[6]。PAHs在意大利的人類母乳樣本中濃度為40.97～259.33 μg·L-1[7]。而在印度的人類血液樣本中也檢出了PAHs，其濃度為57.72～1 007.85 μg·L-1[8]。PAHs和SCCPs的主要作用機制明顯是不同的。大多數(shù)多環(huán)芳烴異構(gòu)體主要作為芳香烴受體(AhR)的激活劑，引起一系列的毒性和生物效應(yīng)，包括誘導(dǎo)細胞色素P4501A1和P4501B1酶，誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化以及致癌毒性[9-11]。另外，PAHs還可以通過改變卵巢雌激素受體蛋白β的表達來干擾破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)[12]。由于SCCPs具有脂肪族化合物結(jié)構(gòu)，因此其可以作為過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的激動劑從而誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖，而過氧化物酶體增殖通常與加速脂肪酸降解、肝損傷以及潛在的致癌性有關(guān)[13-15]。此外，SCCPs能夠通過與雌激素受體蛋白α和腎上腺皮質(zhì)激素受體結(jié)合表現(xiàn)出內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[16]。目前為止，還沒有關(guān)于PAHs和SCCPs聯(lián)合毒性的研究。

肝臟是PAHs和SCCPs共同的主要作用靶器官[10,13,17-18]。因此本研究中我們?nèi)赃x用與肝細胞同源且保留肝臟眾多特殊功能的肝癌細胞HepG2細胞作為受試細胞模型來評價PAHs、SCCPs以及它們的聯(lián)合暴露毒性[19]。大部分外源化合物都會引起細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。因此本文章研究了PAHs和SCCPs單獨和聯(lián)合暴露對HepG2細胞內(nèi)ROS含量、抗氧化防御系統(tǒng)關(guān)鍵酶(過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT))活性、非酶的谷胱甘肽(GSH)以及脂質(zhì)過氧化指示物丙二醛(MDA)的含量的影響，并探討聯(lián)合暴露對這些指標的聯(lián)合作用類型。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.2 實驗儀器

Galaxy 48 R型CO2培養(yǎng)箱(美國New Bruns-wick公司)，Tecan多功能酶標儀(Tecan Genesis，瑞士)，Biofuge?Stratos全能臺式高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)，微板振蕩器(LAB-LINE，USA)，超聲細胞破碎儀(SCIENTZ JY 96-IIN，寧波新芝)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和樣品前處理

HepG2細胞在37 ℃、含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液。取對數(shù)期生長的細胞接種至96孔板用于細胞增殖活性測試，接種密度分別為2 × 104細胞/孔，待細胞鋪滿96孔板的80%后進行PAHs和SCCPs的單獨以及聯(lián)合暴露試驗，暴露時間為24 h。取對數(shù)期生長的細胞接種至6孔板用于胞內(nèi)酶活性測試，接種密度為3 × 105細胞/孔，待細胞鋪滿6孔板的80%后進行PAHs和SCCPs的單獨以及聯(lián)合暴露試驗，暴露時間為24 h。PAHs和SCCPs通過溶解在DMSO中引入細胞培養(yǎng)液，暴露濃度設(shè)置為：SCCP混合標樣(總濃度ΣSCCPs為100 μg·L-1)，PAH混合標樣(每種PAH濃度為10 μg·L-1，總濃度ΣPAHs為160 μg·L-1)，PAHs和SCCPs的混合物(混合標樣中PAHs和SCCPs的濃度分別為：ΣPAHs 160 μg·L-1和ΣSCCPs 100 μg·L-1)。DMSO在培養(yǎng)液中的最終濃度為0.05%(V/V)，對照組中只含有0.05%的DMSO。

用于酶活性測定的細胞暴露24 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍后每孔加入0.25%胰酶200 μL消解，加入含有胎牛血清的全培養(yǎng)液200 μL終止消解。每孔加入1 mL PBS，用移液槍輕輕吹打至細胞完全脫離培養(yǎng)皿壁，制成細胞懸液并轉(zhuǎn)移至離心管中，在8 ℃低溫下離心，2 000 g5 min，用1 mL注射器吸棄上清液，加入預(yù)冷過的PBS液約1.5 mL并輕柔吹打重懸細胞，在8 ℃低溫下離心，2 000 g5 min，重復(fù)3次。獲得的細胞樣品加入0.5 mL PBS重懸，在冰浴條件下用超聲細胞破碎儀進行細胞破碎，破碎條件為：超聲10 s，間隔10 s，持續(xù)1 min。獲得的細胞懸液部分直接用于氧化指標、總蛋白濃度的測定。

1.3.2 MTT法檢測細胞活度

用于細胞活度檢測的細胞暴露24 h后，96孔板每孔加入MTT液(5 mg·mL-1，溶于PBS)20 μL，繼續(xù)在37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入150 μL DMSO，溶解活細胞與MTT結(jié)合形成的紫色晶體。室溫下，將96孔板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，采用酶標儀(Tecan Infinite F50)在492 nm波長下檢測各孔吸光度值，細胞活力通過將對照組細胞活力當做100%來計算。

1.3.3 總蛋白濃度及抗氧化指標測定

細胞內(nèi)總蛋白(TP)濃度，谷胱甘肽(GSH)濃度，丙二醛(MDA)濃度，過氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化氫酶(CAT)活性和活性氧自由基(ROS)濃度均采用南京建成試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)來進行測定。操作過程參照我們以前發(fā)表的文獻中報道的方法[22]，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH濃度，采用硫代巴比妥酸法測定MDA濃度，采用水溶性四唑鹽法測定SOD活性，采用鉬酸銨法測定CAT活性，采用DCFH-DA探針法測定ROS含量，具體測定操作和計算按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為確保實驗結(jié)果的可靠性，實驗數(shù)據(jù)均為6次獨立實驗的結(jié)果。用SPSS PASW(SPSS Inc.，Chicago, IL)軟件進行組間差異顯著性檢驗，P< 0.05被認為有顯著差異。另外為了能夠定量區(qū)分PAHs和SCCPs聯(lián)合暴露的類型，我們選擇了判定聯(lián)合作用類型常用的IA(independent action)模型[23]來判定PAHs和SCCPs的聯(lián)合作用類型，計算公式如下所示：

E= 1-(1-EPAHs)×(1-ESCCPs)

基于E值來判別聯(lián)合暴露的作用類型，EPAH、ESCCP和E聯(lián)合分別代表SCCPs、PAHs以及它們的聯(lián)合暴露相對于對照組所引起的變化。當計算的E值接近E聯(lián)合值時，聯(lián)合作用類型被認為是“加和效應(yīng)”；當計算的E值小于E聯(lián)合值時，聯(lián)合作用類型被認為是“協(xié)同效應(yīng)”；當計算的E值大于E聯(lián)合值時，聯(lián)合作用類型被認為是“拮抗效應(yīng)”。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PAHs和SCCPs單獨暴露和聯(lián)合暴露對HepG2細胞增殖活性的影響

與對照組相比，PAHs和SCCPs以及它們的混合物暴露HepG2細胞24 h后，都能導(dǎo)致細胞活度的顯著降低。如圖1所示，在PAHs和SCCPs暴露組中，細胞活度的平均值分別降低了5%和2.5%。而在PAHs和SCCPs的聯(lián)合暴露組中，細胞活度的平均值降低了6.2%。另外根據(jù)PAHs和SCCPs對細胞活度的影響計算的E值(7.4%)大于實際測得的E聯(lián)合值(平均值6.2%)，因此聯(lián)合暴露對細胞活度的影響表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

圖1 PAHs、SCCPs以及它們的聯(lián)合暴露對HepG2細胞增殖活性的影響注：PAHs為多環(huán)芳烴，SCCPs為短鏈氯化石蠟。顯著性變化為暴露組與對照組相比的T統(tǒng)計結(jié)果，* P < 0.05；** P < 0.01。Fig. 1 Viability of HepG2 cells exposed to PAHs, SCCPs and their combination for 24 hNote: PAHs stands for polycyclic aromatic hydrocarbons, and SCCPs stands for short-chain chlorinated paraffins. Significant differences were indicated in comparison of the control by T-test. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

2.2 PAHs和SCCPs單獨暴露和聯(lián)合暴露對HepG2細胞內(nèi)ROS含量的影響

如圖2所示，與對照組相比，ROS含量在PAHs、SCCPs和聯(lián)合暴露組中都升高，但是只有在SCCPs和聯(lián)合暴露組中顯著升高(P<0.01)。ROS含量的平均值在PAHs和SCCPs暴露組中分別升高了5.5%和17.4%，用這2個變化值計算得到聯(lián)合暴露組E值為22%，小于實際聯(lián)合暴露引起的ROS含量相對升高量(平均值27.7%)，因此聯(lián)合暴露對ROS含量的影響表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

2.3 PAHs和SCCPs單獨暴露和聯(lián)合暴露對HepG2細胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

圖3 PAHs、SCCPs及聯(lián)合暴露24 h對HepG2細胞內(nèi)SOD活性和CAT活性的影響注：顯著性變化為暴露組與對照組相比的T統(tǒng)計結(jié)果，* P < 0.05；** P < 0.01。Fig. 3 Changes of SOD and CAT activities in HepG2 cells exposed to PAHs, SCCPs and their combination for 24 hNote: Significant differences were indicated in comparison of the control by T-test. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

圖4 PAHs、SCCPs及聯(lián)合暴露24 h對HepG2細胞內(nèi)GSH和MDA含量的影響注：顯著性變化為暴露組與對照組相比的T統(tǒng)計結(jié)果，* P < 0.05；** P < 0.01。Fig. 4 Changes of GSH and MDA concentrations in HepG2 cells exposed to PAHs, SCCPs and their combination for 24 hNote: Significant differences were indicated in comparison of the control by T-test. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

如圖3a所示，與對照組相比，SOD的活性在3個暴露組中都呈現(xiàn)降低趨勢，但是只有在聯(lián)合暴露組中才顯著降低。SOD活性平均值在PAHs和SCCPs暴露組中分別降低了2%和7%，用這2個值計算的聯(lián)合暴露組E值為8.9%，小于聯(lián)合暴露實際引起的SOD活性相對降低值(平均值12%)，因此聯(lián)合暴露對SOD活性的影響表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。與對照組相比，細胞內(nèi)CAT的活性在SCCPs暴露組中顯著下降，而在PAHs和聯(lián)合暴露組中分別呈現(xiàn)輕微的升高和降低趨勢，但是都不具有顯著性差異(圖3b)。在PAHs和SCCPs暴露組中，CAT活性相對改變平均值分別為4%和47.4%，用這2個值計算的聯(lián)合暴露組E值為49.5%，遠大于聯(lián)合暴露實際引起的CAT活性相對變化值(平均值8.4%)，因此聯(lián)合暴露對CAT活性的影響表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

2.4 PAHs和SCCPs單獨暴露和聯(lián)合暴露對HepG2細胞內(nèi)GSH、MDA含量的影響

如圖4a所示，與對照組相比，GSH的含量在PAHs和SCCPs單獨暴露組中都有輕微下降趨勢，而在聯(lián)合暴露組中呈現(xiàn)出輕微上升趨勢。GSH含量平均值在PAHs和SCCPs暴露組中分別降低了9.4%和6.6%，用這2個值計算的聯(lián)合暴露組E值為15.4%，遠大于聯(lián)合暴露實際引起的GSH含量相對變化值(平均值3.3%)，，因此聯(lián)合暴露對GSH含量的影響表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。與對照組相比，細胞內(nèi)MDA的含量僅在SCCPs暴露組中顯著升高(圖4b)。在PAHs和SCCPs暴露組中，MDA含量平均值分別改變了0.8%和7.3%，用這2個值計算的聯(lián)合暴露組E值為8%，大于聯(lián)合暴露實際引起的MDA含量相對變化值(平均值5.8%)，，因此聯(lián)合暴露對MDA含量的影響表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

2 討論(Discussion)

在以前的研究中，PAHs和SCCPs都被證明能夠引起機體的氧化損傷，而氧化損傷則會引起一系列損傷，包括降低異檸檬酸脫氫酶活性、DNA損傷、細胞凋亡等等[8,15,24-27]。但是PAHs和SCCPs的聯(lián)合暴露對細胞氧化損傷還沒有得到研究。由于環(huán)境化學(xué)污染物通常以低濃度混合物形式存在，且PAHs和SCCPs是2種典型且環(huán)境介質(zhì)中普遍存在的有機污染物，因此研究它們的聯(lián)合暴露具有重要的意義。本實驗以HepG2細胞為研究對象，探討了環(huán)境濃度的PAHs和SCCPs單獨暴露以及聯(lián)合暴露對細胞增殖活性和抗氧化系統(tǒng)的干擾作用。結(jié)果表明PAHs、SCCPs以及它們的聯(lián)合暴露都引起了細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，進一步導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，最終導(dǎo)致細胞損傷，甚至凋亡。

正常情況下，ROS作為新陳代謝過程中產(chǎn)物在機體中會不斷產(chǎn)生，同時體內(nèi)的抗氧化酶以及非酶抗氧化劑能夠清除細胞內(nèi)多余的活性氧，抗氧化體系各成員之間通過相互協(xié)調(diào)維持機體氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡。在以前多個研究中，PAHs被證明能夠引起ROS的產(chǎn)生[26-28]。而在本研究中，PAHs、SCCPs以及聯(lián)合暴露后，HepG2細胞內(nèi)都產(chǎn)生大量的ROS，尤其是聯(lián)合暴露組中ROS產(chǎn)生量最大，聯(lián)合暴露在引發(fā)ROS產(chǎn)生的效應(yīng)上表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。ROS在與細胞生長相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑中扮演著極其重要的角色，例如PI3K/Akt信號通路等[29]。ROS對促進細胞有絲分裂，誘導(dǎo)細胞增殖是至關(guān)重要的，在一定濃度范圍內(nèi)，這種促細胞增殖的能力與的ROS水平呈正相關(guān)[30]。然而由于腫瘤細胞長期處于ROS高水平的狀態(tài)，腫瘤細胞的氧化還原體系相對正常細胞更為脆弱，對ROS的調(diào)控能力更低，當ROS大量產(chǎn)生時腫瘤細胞受到ROS攻擊，比正常細胞更易于死亡[31]。在以往的研究中，都觀察到了PAHs和SCCPs對HepG2細胞活度顯著的抑制效應(yīng)[15,32-33]。在本研究中，PAHs和SCCPs以及它們的混合物暴露HepG2細胞24 h后，都能導(dǎo)致細胞活度的顯著降低，且聯(lián)合暴露也引起細胞活度的顯著降低。

為了抵抗污染物帶來的氧化壓力，細胞內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)發(fā)生了一系列變化。生物體內(nèi)的抗氧化劑主要指SOD、CAT和過氧化物酶以及非酶抗氧化劑GSH。在以往的研究中，PAHs暴露后SOD和CAT的活性基本呈現(xiàn)升高的趨勢，且GSH也被消耗，從而消除產(chǎn)生的ROS[34]。而在本研究中PAHs引起了CAT活性的升高和GSH含量的降低，但均無統(tǒng)計學(xué)意義，另外SOD的活性還呈現(xiàn)輕微的降低趨勢，這可能與所用的受試模型以及濃度有關(guān)，在以前的一篇文獻中PAHs在低劑量時也引起SOD活性的降低[35]。在本研究中，SCCPs暴露以及聯(lián)合暴露后，SOD活性和CAT活性都大大降低，這也就導(dǎo)致了細胞內(nèi)ROS不能得到及時清除，在細胞內(nèi)大量積累。另外PAHs和SCCPs暴露后GSH含量有降低趨勢，而聯(lián)合暴露后GSH含量反而有輕微的升高趨勢，推測聯(lián)合暴露也抑制了GSH消除ROS的過程，導(dǎo)致聯(lián)合暴露組中ROS的積累量最高。細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化形成MDA。而研究結(jié)果表明SCCPs暴露引起了MDA含量顯著升高，這可能與SCCPs能夠誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖有關(guān)，因為過氧化物酶體增殖通常能夠加速脂肪酸β-氧化。然而PAHs和聯(lián)合暴露并沒能引起MDA含量的顯著變化。與先前文獻報道中PAHs也沒能引起砂海螂體內(nèi)MDA含量顯著變化的結(jié)果相一致[36]。

總體來說，PAHs、SCCPs和它們的聯(lián)合暴露都能夠干擾HepG2細胞內(nèi)部的抗氧化系統(tǒng)，破壞抗氧化系統(tǒng)和自由基之間的平衡，使細胞氧化性損傷。PAHs和SCCPs暴露都能引發(fā)ROS的產(chǎn)生，兩者混合時更加劇了ROS的產(chǎn)生，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。另外，PAHs和SCCPs暴露都能引起SOD酶活性的降低，因此兩者混合時共同抑制SOD酶活性，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。而PAHs引起CAT活性升高，SCCPs則顯著抑制CAT酶活性，兩者聯(lián)合暴露時CAT酶活性仍然降低，但表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。另外，PAHs和SCCPs聯(lián)合暴露對GSH含量和MDA含量的影響也表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。綜上，PAHs和SCCPs聯(lián)合暴露后，降低了SOD和CAT的活性，GSH也沒有被大量消耗，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS不能得到及時清除，造成細胞一系列的損傷變化甚至細胞凋亡。本研究選擇了單一濃度的PAHs和SCCPs進行單獨和聯(lián)合暴露，而聯(lián)合毒性與污染物的濃度范圍和混合配比密切相關(guān)，因此不同的濃度和配比的PAHs和SCCPs對氧化系統(tǒng)的聯(lián)合作用需要進一步的研究和確認。