林曼霞，鄒勇，孫永學

國家獸藥安全評價(環(huán)境評估)實驗室(華南農大)，國家獸醫(yī)微生物耐藥性風險評估實驗室，廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州 510642

在畜禽養(yǎng)殖生產中大量的抗生素用于預防和治療動物疾病，其中，土霉素(oxytetracycline, OTC)作為大量獸用抗生素中四環(huán)素類使用最廣泛的一種[1],是一種廣譜抗菌藥，被廣泛應用于豬、家禽等動物的疾病預防和感染，且由于其廣譜抗菌活性及費用低等優(yōu)點常被作為畜禽的抗菌促生長劑[2-3]。但是，土霉素進入畜禽體后,大部分藥物無法被吸收，以原形及其體內代謝產物隨糞尿等排泄物進入環(huán)境,其中主要一部分作為肥料施加于土壤中，導致土壤中抗生素的長期積累，給環(huán)境帶來風險[4-6]。

國內有學者研究了溫度、水分、pH值、施肥等因素對土壤反硝化的影響[8-12]，而關于含有抗生素的糞便施加于土壤中對反硝化作用影響的研究仍然較少。故本試驗構建室內抗生素-糞便-土壤模型，通過添加不同濃度的土霉素，并結合運用熒光定量PCR和限制性末端片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術研究反硝化中微生物的響應特征，揭示不同濃度土霉素存在條件下，土壤反硝化作用以及土壤微生物之間的關系，以期為減少農田菜地氮素流失等氮肥管理提供科學依據，并為開展系統(tǒng)的生態(tài)毒理學研究與科學評估做基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 土壤、雞糞采集及處理

供試菜地土采自華南農業(yè)大學農學院實驗基地土(東經113°21’6″，北緯23°9’53″)，取樣深度為0～20 cm。土壤運回實驗室后，過2.0 mm 篩后避光于20 ℃條件下靜置7 d，測得pH值為5.77，全碳含量為77.0 mg·kg-1，全氮占0.066%，全磷占0.027%，銨態(tài)氮為2.23 mg·kg-1，硝態(tài)氮為9.24 mg·kg-1，土壤類型為砂質粘壤土。雞糞采集自飼喂無任何抗生素的SPF雞，陰干，過2.0 mm篩于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 構建室內抗生素-糞便-土壤模型

設置空白組，低、中、高濃度土霉素添加組共4組，每組設置3個重復。每千克土壤中加入20 g雞糞，土霉素低、中、高濃度分別為20 μg·kg-1、200 μg·kg-1、2 000 μg·kg-1土壤。噴灑純水至最大持水率的50%并攪拌均勻，分裝于43 cm×18 cm×13 cm的塑料盆中，每盆4 kg，在室溫20 ℃下，12 h光照下培養(yǎng)。在第1、7、14、30、60天采集土壤樣品放置-20 ℃保存。

1.3 土壤總DNA提取

取1 g土壤樣品，按照土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)說明書提取土壤總DNA，DNA的濃度和質量用核酸蛋白儀(NanoDrop, USA)進行測量，于-20 ℃保存。

1.4 熒光定量PCR

功能基因的定量分析采用SYBR GREEN法，檢測硝酸鹽還原酶基因narG,亞硝酸鹽還原酶基因nirS、nirK，一氧化氮還原酶基因nosZ的絕對定量。20 μL的q-PCR反應體系，包括SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、dd H2O(7.4 μL)、上下游引物(各0.8 μL)和DNA模板(1 μL)。每個樣品設置3個重復，在Roche LightCycler96進行反應。定量引物和擴增條件見表1。

1.5 末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)分析

提取土壤總DNA按照上述熒光定量的條件進行PCR擴增，nirS基因擴增產物使用內切酶HaeⅠ(TaKaRa)酶切,nosZ基因使用內切酶HaeⅢ(TaKaRa)酶切，酶切體系(20 μL)包含：PCR產物15 μL，HaeⅠ或HaeⅢ 1 μL，10×Bufffer 2 μL，ddH2O 2 μL。于37 ℃恒溫箱中反應3 h,然后將酶切產物送往上海生工純化、電泳以及測序。T-RFLP圖譜分析使用GeneMapper (Applied Biosystems)軟件進行分析，根據標準樣品ROX-500的檢測范圍，選取大于50 bp,小于500 bp片段，計算每個檢測峰的峰高所占檢測峰總數的百分比，剔除小于1%的值。

1.6 數據處理

實驗中的數據作圖分析在Origin 8中完成，統(tǒng)計分析在SPSS 19.0軟件中進行，其中，對T-RFLP的結果采用主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)來研究樣品間群落組成的差異。

圖1 土霉素(OTC)暴露下nirS、nirK、narG和nosZ反硝化基因豐度Fig. 1 Abundance of nirS, nirK, narG and nosZ denitrification genes after exposure to oxytetracycline (OTC)

基因Gene引物Primer序列Sequence片段長/bpFragment length/bp反應條件ConditionnirSnirS cd3aFF-GTSAACGTSAAGGARACSGGnirS R3cd[13]R-GASTTCGGRTGSGTCTTGA42095 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 58 ℃/30 s, 72 ℃/45 s nirKnirK FlaCuF-ATCATGGT(C/G)CTGCCGCGnirK R3Cu[13]R-GCCTCGATCAG(A/G)TTGTGGTT47295 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 57 ℃/60 s, 73 ℃/60 snosZnosZ Z-FF-CGYTGTTCMTCGACAGCCAGnosZ Z1622-R[13]R-CGCRASGGCAASAAGGTSCG72095 ℃/30 s; 95 ℃/30 s, 60 ℃/60 s, 72 ℃/60 snarGnarG FF-TAYGTSGGGCAGGARAAACTGnarG R[14]R-CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGT11095 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 55 ℃/30 s, 72 ℃/30 s

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 不同濃度土霉素對反硝化功能基因豐度變化影響

從圖1(A)中可以看出，空白組nirS基因豐度隨著時間的推移而逐漸下降，且在相同時間不同濃度處理時高濃度組與其他濃度組在第1、14天呈顯著性差異(P<0.05)，說明第1天較高濃度的土霉素對土壤中攜帶nirS基因菌群能產生抑制作用，而到第14天時高濃度組nirS基因豐度有所上升。而在相同濃度不同時間情況下，第1天空白組與其他時間組呈顯著性差異(P<0.05)，其他不同濃度組差異不顯著。低、中濃度土霉素對nirS基因豐度有促進作用，而高濃度有抑制作用。

圖1(B)中在相同時間不同濃度處理中第7天的空白組與低、中濃度組以及第30天的空白組與其他組差異顯著(P<0.05)，而在相同濃度不同時間下，各濃度在第1和第7天的差異顯著(P<0.01)，且nirK基因豐度呈先上升后下降的趨勢。其中低、中濃度仍然對nirK基因豐度有促進作用，基因豐度基本在空白組之上，高濃度則基本上呈抑制作用。

圖1(C)相同時間不同濃度處理中，空白組與其他組在第1天narG基因豐度差異顯著(P<0.01)，其中，低、中、高濃度對攜帶narG基因的微生物均有抑制作用且高濃度抑制作用最明顯。其次，高濃度在第14天與其他組差異也顯著(P<0.01)，高濃度在第14天narG基因豐度高于其他各組。而在相同濃度不同時間下，空白組在第1天和第30、60天差異顯著(P<0.01)，說明攜帶narG基因菌群隨時間的增長而變化明顯，而最后到第60天時，各組基因豐度基本達到一致的平衡水平。

圖2 不同濃度土霉素處理下的nirS型反硝化細菌的T-RFs相對百分比和細菌群落的主成分分析Fig. 2 Relative percentage of T-RFs and principal component analysis of nirS-type denitrifying bacteria at different concentrations of oxytetracycline

圖1(D)顯示相同時間不同濃度處理中，低濃度組與其他組在第7天nosZ基因豐度差異顯著(P<0.01)，低濃度組nosZ基因豐度在第7天增長明顯，之后又下降到低于空白組。相同濃度不同時間下，低濃度第7、60天與其他時間組的nosZ基因豐度差異顯著(P<0.05)，而其他濃度組第60天與第30天差異顯著(P<0.05)，說明nosZ基因對低濃度的土霉素反應較為敏感。而中、高濃度基本呈抑制趨勢，但是各濃度組在第30～60天卻都呈上升趨勢。

綜合以上分析，nirS、nirK兩個基因豐度中各濃度的變化規(guī)律除了第一天之外基本一致，而narG和nosZ反硝化基因豐度變化卻和上述兩種不同。

2.2 不同濃度土霉素對土壤中反硝化微生物群落結構變化影響

本實驗對nirS、nosZ基因的群落結構進行了分析，T-RFLP分析結果顯示，限制性內切酶HaeⅠ獲得21個nirS基因片段(>1%)，分別為53 bp、57 bp、60 bp、62 bp、75 bp、76 bp、77 bp、78 bp、79 bp、87 bp、114 bp、115 bp、116 bp、117 bp、133 bp、136 bp、137 bp、138 bp、210 bp、225 bp、259 bp T-RFs(圖2(A))。

圖3 不同濃度土霉素處理下的nosZ型反硝化細菌的T-RFs相對百分比和細菌群落的主成分分析Fig. 3 Relative percentage of T-RFs and principal component analysis of nosZ-type denitrifying bacteria at different concentrations of oxytetracycline

在第1～14天，各濃度土霉素對土壤中nirS基因代表的反硝化微生物群落結構組成影響并無明顯差異，78和115片段均為優(yōu)勢片段，分別約占22%～34%和11%～22%。而第30～60天時78 bp和115 bp的T-RFs比例逐漸下降，到第60天時最為明顯，分別約占8%～13%、7%～14%,而此時76 bp成為優(yōu)勢片段，約占16%～22%。這些結果間接表明雖然在不同濃度土霉素壓力脅迫對攜帶nirS基因的優(yōu)勢菌群的影響不大，但是隨著時間的增長以及土壤中營養(yǎng)物質的消耗，土壤中的優(yōu)勢菌群發(fā)生了改變。

根據nirS基因T-RFs數據進行主成分分析(圖2(B))，發(fā)現(xiàn)第一主成分PC1解釋了61.2%的物種變量，第二主成分PC2解釋了17.1%的物種變量。由圖看出不同濃度土霉素對主成分并沒有明顯的影響，但是可以觀察到第30天和第60天的各濃度組全分布在PC1的正軸，而第1、7、14天均在PC1的負軸，說明可能隨著時間增長，土壤營養(yǎng)物質減少，土壤中攜帶nirS基因的優(yōu)勢菌群發(fā)生了變化。

而限制性內切酶HaeⅢ獲得22個nosZ基因片段(>1%)，分別為51 bp、54 bp、110 bp、111 bp、112 bp、113 bp、114 bp、115 bp、116 bp、131 bp、133 bp、134 bp、148 bp、149 bp、152 bp、153 bp、209 bp、210 bp、278 bp、279 bp、386 bp、392 bp(圖3(A))。從圖中可以看出1～60天，各濃度組土霉素藥物濃度對土壤中反硝化微生物群落結構組成影響亦并無明顯差異，其中209 bp和210 bp為優(yōu)勢片段，分別占21%～37%、9%～16%。隨著時間的增加，優(yōu)勢片段仍然是209 bp和210 bp，說明土壤中的營養(yǎng)物質消耗亦并不能改變攜帶有nosZ基因的優(yōu)勢菌群。攜帶有209 bp和210 bp片段的微生物所占比例之和接近50%，也就是說，含有nosZ基因的細菌較為固定，不易受外界影響。

根據nosZ基因T-RFs數據進行主成分分析(圖3(B))，發(fā)現(xiàn)第一主成分PC1解釋了54.0%的物種變量，第二主成分PC2解釋了17.8%的物種變量。由圖3(B)可以看出第1天和第60天在PC1的正軸，而1、7、14、30、60天的均有濃度在PC2的正軸，但各藥物濃度對主成分沒有明顯的影響，說明各濃度土霉素和土壤營養(yǎng)物質對攜帶nosZ基因的優(yōu)勢片段并沒有太大的影響。

3 討論(Discussion)

反硝化作用在自然界中扮演重要的角色，其中主要由反硝化細菌起作用，而自然界中的反硝化菌群落結構受到各種環(huán)境因素的影響[15]，主要有水分、溫度、pH、碳氮類型、土壤質地等等[8-10]。但是國內關于抗生素對土壤反硝化作用影響的報道卻仍然較少，本試驗研究結果發(fā)現(xiàn)，低、中濃度的土霉素對土壤中攜帶nirS、nirK反硝化基因菌群有促進作用，而高濃度有抑制作用。而高濃度組nirS基因豐度在第14天有所上升，可能是部分攜帶nirS基因菌群適應抗生素壓力后的結果。nirK基因豐度在第7天時上升明顯，可能是施加雞糞對攜帶有nirK基因的菌群提供營養(yǎng)，使其在短期內豐度增加，之后隨著營養(yǎng)物質的消耗，基因豐度也隨著下降。narG基因豐度在第14天時高濃度組高于其他各組，這可能與攜帶narG基因的菌群適應高濃度的抗生素壓力后短時間內菌群數量回升有關。但是隨著時間的增加，nirS、nirK、narG基因豐度均在緩慢下降，這與劉款[16]的研究相一致。nirS、nirK基因豐度變化規(guī)律除了第一天不同之外基本相同，有研究報道，nirS、nirK基因被認為是外界壓力條件下的重要指示基因，兩者甚至可相互替代[17-18]，所以在第一天時nirS、nirK基因豐度表現(xiàn)不一致甚至相反。而nosZ基因豐度變化規(guī)律似乎與其他基因無關，在第60天時各濃度基因豐度增加，猜想可能是nosZ基因控制的氧化亞氮還原酶是反硝化最后一個過程，對抗生素壓力的反應一開始較為遲鈍，而隨時間的增加逐漸恢復敏感度。因為關于這個現(xiàn)象目前還沒有相關方面的報道,具體影響機制尚不清楚，有待后期進一步試驗證明。4個反硝化基因豐度變化趨勢不同說明控制反硝化過程不同階段的酶對土霉素壓力下反應不同，控制同一階段的酶可由2種或2種以上的基因共同決定，且其變化規(guī)律基本一致。

T-RFLP分析結果表明雖然土霉素各濃度對土壤中攜帶有nirS基因優(yōu)勢片段影響不大，但是雞糞作為有機肥料可能對優(yōu)勢片段的影響卻隨著時間的增加而改變。說明攜帶有nirS基因的細菌可能更易受環(huán)境含碳氮物質影響。這與尹昌[19]發(fā)現(xiàn)有機肥的施加對土壤中nirS型反硝化菌種群的群落結構和豐度有顯著影響的結果相一致。而攜帶有nosZ基因的菌群卻表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的趨勢，各不同濃度的土霉素藥物以及雞糞都對其優(yōu)勢片段沒有太大的影響。說明施肥和抗生素壓力對nosZ基因群落多樣性和群落結構影響均不顯著。這與之前的學者的研究發(fā)現(xiàn)一致，即不同環(huán)境條件下nosZ基因群落組成變化不大[20-21]，nosZ基因在土壤中表現(xiàn)相對穩(wěn)定，不易受到外界環(huán)境的影響[17,22]。亞硝酸還原酶(nir)比氧化亞氮還原酶(nos)對外界環(huán)境條件變化的響應更加敏感，這可能與反硝化進行的深度有關。換句話說，土霉素對反硝化過程的前2個環(huán)節(jié)影響較大，而對最后一個環(huán)節(jié)的還原影響較小。這也同時可以解釋為什么常把nirS作為環(huán)境中反硝化菌群變化的指示基因,而不選擇nosZ基因的原因。

本實驗還存在的不足之處是沒有進一步跟蹤雞糞作為碳源以及土霉素隨時間的增加而消耗和降解的動態(tài)過程，有必要在今后的研究中增加土壤中總碳含量的變化規(guī)律以及抗生素殘留的檢測，以得到更加充分的數據支持。

綜上，本試驗通過模擬室內施糞菜地土壤模型，研究土霉素脅迫下反硝化分子的響應特征，通過熒光定量和用T-RFLP技術，可以初步得到以下結論：

(1)低(20 μg·kg-1)、中(200 μg·kg-1)濃度土霉素可以促進土壤反硝化基因的響應速度，而高濃度(2 000 μg·kg-1)則有抑制作用。說明長期施加含有低、中濃度范圍的畜禽糞便對土壤中氮肥會造成損失，不利于農作物的生長。而高濃度則會直接抑制土壤菌群的生長，對土壤微生物造成破壞。

(2)反硝化基因nirS相比nosZ基因來說對環(huán)境變化更加敏感，更適合作為反硝化作用變化的指示基因和分子標記。

致謝：感謝國家自然科學基金(31772803)；廣東省自然科學基金(2016A030311029)給予的支持。