楊鈺昆，楊文飛，常媛媛，郭園園，翟豆豆，王 津，王興華,*

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006；3.山西農業(yè)大學信息學院環(huán)境科學與食品工程系，山西 晉中 030800）

鎘（Cd）以其移動性大、毒性高、污染面積最大成為當代環(huán)境中影響人類健康的主要污染物之一，對人體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等均具有明顯的毒害作用[1-2]。鎘的毒性作用與其可以誘發(fā)自由基、誘導脂質過氧化有關[3-4]，大量研究表明，鎘會導致機體發(fā)生氧化應激作用進而誘導生物體產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），而ROS可以通過對細胞內大分子生物物質如蛋白質、DNA、脂質等的攻擊，引起機體氧化脅迫損傷[5-11]。Yang Jingli等[12]研究表明抗氧化酶和ROS清除劑在抵御鎘脅迫損傷中具有重要作用，硒是人體必需的微量元素，它是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性成分，同時可以改善生物體內其他抗氧化酶的活性，保護細胞和細胞膜免受氧化損傷[13-14]。

隨著對硒的抗氧化作用的研究，已有實驗證實硒可以通過多種途徑拮抗鎘引起的毒性效應，但這些實驗大多是在動物或植物體內進行[15]，具有周期長、影響因素復雜等缺點，而近些年來對硒的抗氧化性偏向分子機制研究，用動植物材料進行研究更是受到諸多限制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不僅在傳統(tǒng)的食品工業(yè)方面有著廣泛的應用，而且還是現(xiàn)代細胞生物學以及分子生物學研究中一種重要的模式生物[16-18]。釀酒酵母具有價格便宜、容易培養(yǎng)、生長快速、無致病性、基因組較小、與人類在某些方面具有同源性等特點，可以被用作研究重金屬響應機制的模式生物[19-22]。目前應用釀酒酵母作為模式生物、利用硒作為拮抗劑來研究硒拮抗重金屬鎘引起的氧化脅迫機制的相關文獻較少。

本實驗旨在研究不同硒、鎘條件對釀酒酵母生長的影響及硒拮抗劑對鎘處理組釀酒酵母細胞生長的影響，通過比較添加硒拮抗劑前后鎘對酵母細胞內ROS、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及幾種主要抗氧化酶活性的影響探究在釀酒酵母體內硒拮抗鎘引起的氧化脅迫的機制。本研究可以為后續(xù)將釀酒酵母作為模式生物研究重金屬氧化脅迫機制及鎘拮抗劑的作用機理提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母EGY48菌株保存于本實驗室。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH值自然。

CdCl2·2.5H2O、無水亞硒酸鈉等均為國產分析純；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、GSH-Px測試盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母菌體濃度與OD600nm相關性分析

挑取保存于固體培養(yǎng)基上的酵母單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；取適量活化的菌液以2%接種量添加到YPD培養(yǎng)基中，用分光光度計測定初始OD600nm并用血球計數(shù)板測定菌體濃度，每隔2 h進行一次測定。對OD600nm和菌體濃度兩組數(shù)據(jù)進行相關性分析。

1.3.2 測定不同濃度硒、鎘對釀酒酵母生長的影響

依據(jù)生長曲線，在細胞生長對數(shù)期取酵母細胞，分別加至含有不同濃度鎘（0、50、250、500、1 000 μmol/L）及硒（0、5、10、20、50、100、150 μmol/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，通過稀釋使培養(yǎng)液的初始OD600nm值一致后，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。每隔2 h測定培養(yǎng)液的OD值，根據(jù)式（1）計算各處理組的生長抑制率。選擇生長抑制率為50%的鎘濃度（EC50）和可以顯著（P＜0.05）促進釀酒酵母細胞生長的硒濃度進行后續(xù)實驗。

1.3.3 硒對鎘處理組釀酒酵母細胞生長的影響

取適量菌細胞至鎘濃度為EC50的培養(yǎng)液中，同時加入一定濃度的硒，測定培養(yǎng)液的OD600nm值。以生長對數(shù)期的菌懸液OD600nm為主要參數(shù)，以培養(yǎng)液的初始OD600nm及未添加硒和鎘的空白培養(yǎng)液OD600nm為對照，計算生長抑制率。選擇一個合適的硒濃度進行后續(xù)實驗。后續(xù)實驗分為4 種處理方式進行實驗，即空白對照組、EC50鎘處理組、選定濃度硒處理組和EC50鎘及選定濃度硒共同處理組并分別編號為0、1、2、3。

1.3.4 不同處理對釀酒酵母菌落生長的影響

用美蘭染色法測定不同處理組死亡率，取在不同預處理12 h后培養(yǎng)液中大小相同的濾紙接種到不同的培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h之后用游標卡尺測量平板直徑，并用Motic Images Plus 2.0軟件中的三點圓測定方式對其菌落半徑進行測量。

1.3.5 不同處理組ROS水平測定

低溫下收集各處理組12 h時的菌體，按說明書逐步處理，用流式細胞儀測定不同處理組的ROS含量，用Cell Quest Pro軟件進行數(shù)據(jù)采集，每個樣本采集20 000 個細胞，用FlowJo 7.6.1進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 GSH、MDA含量及各酶活性測定

取不同處理組釀酒酵母細胞培養(yǎng)液5 mL，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌生理鹽水中洗滌2次，加入一定量PBS，置于冰上超聲波破碎19 min（超聲時間/間歇時間16 s/16 s，超聲功率455 W）得粗提液。分別測定粗提液中各重要抗氧化酶活性及谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、MDA含量。蛋白質量濃度用考馬斯亮藍法測定，測定標準曲線方程為y=0.001 5x-0.002 7（R2=0.993 6）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌體濃度與OD600 nm的相關性分析

圖1 菌體濃度（A）及OD600 nm（B）隨培養(yǎng)時間的變化Fig. 1 Change in bacterial concentration (A) and OD600 nm (B) with culture time

由圖1可以看出，菌體濃度和培養(yǎng)液OD600nm變化趨勢呈現(xiàn)出高度的一致性，且均在4 h左右開始進入對數(shù)生長期，從12 h開始漸漸進入平臺期，選擇4～12 h做釀酒酵母菌體濃度與OD600nm相關性分析結果如圖2所示。

圖2 菌體濃度與OD600 nm相關性Fig. 2 Correlation between bacterial concentration and OD600 nm

由圖2可以看出，在4～12 h內釀酒酵母菌體濃度與培養(yǎng)液OD600nm呈線性正相關，且擬合方程的R2為0.989 0，P＜0.001，故在后續(xù)實驗中可以用培養(yǎng)液OD600nm間接表示培養(yǎng)液中釀酒酵母菌體濃度。

2.2 鎘對釀酒酵母生長曲線的影響

圖3 鎘對釀酒酵母生長曲線的影響Fig. 3 Inf l uence of cadmium on S. cerevisiae growth curve

圖4 鎘濃度在第12小時對釀酒酵母的生長抑制率的影響Fig. 4 Growth inhibition rate at different concentrations of cadmium at 12 h

基于從生長曲線測定階段得出釀酒酵母從第12小時開始進入平臺期（圖3），故對第12小時不同濃度鎘對釀酒酵母生長的抑制率進行了單獨分析，結果見圖4。鎘可以顯著抑制釀酒酵母細胞生長（P＜0.05），隨著鎘濃度的增加和作用時間延長，鎘對釀酒酵母生長的抑制也更加顯著，在鎘濃度為500 μmol/L時，對酵母細胞生長的抑制率達到95%（P＜0.05）。選擇生長抑制率接近50%（P＜0.05）的鎘濃度200 μmol/L（EC50）作為后續(xù)實驗的鎘處理濃度。

2.3 硒對釀酒酵母細胞生長的影響

圖5 硒濃度對釀酒酵母OD600 nm的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of selenium on S. cerevisiae growth

由圖5可知，濃度為5、20、50 μmol/L的硒對釀酒酵母的生長有一定的促進作用，且以50 μmol/L的硒處理組釀酒酵母的生長最好，而硒濃度大于100 μmol/L時對酵母細胞的生長表現(xiàn)抑制作用，故在后續(xù)實驗中設計硒濃度為25、50、75 μmol/L三個水平來探究硒對鎘毒性的拮抗作用，這3個梯度的硒在6 h和12 h對添加200 μmol/L鎘后釀酒酵母生長的影響如圖6所示。

圖6 硒濃度對鎘毒性拮抗作用的影響Fig. 6 Antagonistic effect of different concentrations of selenium on cadmium toxicity

由圖6可知，處理第6和12小時50 μmol/L硒處理組均有表現(xiàn)出高水平的拮抗作用。按4 種不同的處理方式0、1、2、3號組得到的釀酒酵母的生長曲線如圖7所示。

圖7 硒鎘處理條件對釀酒酵母生長曲線的影響Fig. 7 Effects of different combinations of selenium and cadmium on S. cerevisiae growth curve

從圖7可知，50 μmol/L硒可以顯著（P＜0.05）拮抗200 μmol/L鎘對釀酒酵母生長的抑制作用，故選擇50 μmol/L的硒進行后續(xù)實驗。

2.4 不同處理對釀酒酵母菌落生長的影響

在用0、1、2、3號組4 種不同預處理方式培養(yǎng)釀酒酵母12 h后，接種于0、1、2、3號組各自對應不含硒和鎘的YPD培養(yǎng)基（YPD）、含有200 μmol/L鎘的培養(yǎng)基（Cd200）、含有50 μmol/L硒（Se50）的培養(yǎng)基和同時含有50 μmol/L硒和200 μmol/L鎘（Cd200+Se50）的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間后對其菌落生長形態(tài)進行觀察比較。

圖8 預處理后釀酒酵母在不同培養(yǎng)基上菌落半徑比較Fig. 8 Comparison of colony radius of S. cerevisiae on different media after pretreatment

實驗結果表明：在相同的培養(yǎng)基上，0號和2號預處理組菌落與1、3號預處理組對應的菌落相比較菌落邊緣整齊，質地均勻，致密度良好，1號預處理菌落幾乎不生長或只是分布有一些小菌落，可能是部分菌體在生長過程中死亡導致，尤其在Cd200培養(yǎng)基上菌落幾乎沒有生長，3號預處理組菌落和1預處理相比較菌落較為稀薄。不同預處理后釀酒酵母在培養(yǎng)基上的菌落呈粉紅色可能與菌體富硒有關[23]。從圖8可以看出，在Cd200培養(yǎng)基上各預處理后的菌落半徑均顯著小于在YPD培養(yǎng)上的菌落半徑（P＜0.05）。經過1號組預處理之后，可以看出鎘的預處理對酵母生長具有較強的抑制作用，而在Se50和Cd200+Se50培養(yǎng)基上的菌落半徑與YPD上的菌落半徑沒有顯著性差異，從而說明硒對鎘對酵母生長的抑制作用具有拮抗性能。1、3號預處理組在Se50及Cd200+Se50培養(yǎng)基上的菌落半徑均顯著大于在Cd200培養(yǎng)基上菌落半徑（P＜0.05）。

2.5 硒對鎘誘導的酵母細胞ROS含量升高的影響

圖9 加硒對鎘誘導的釀酒酵母ROS含量升高的影響Fig. 9 Effects of selenium on cadmium-induced increase in ROS level in S. cerevisiae

由圖9可以看出，200 μmol/L鎘可以極顯著誘導酵母細胞內ROS含量的升高（P＜0.01），達到空白對照組5 倍的水平，50 μmol/L硒單獨處理組酵母細胞內ROS含量略有降低但變化不顯著，而在添加200 μmol/L鎘的培養(yǎng)液中加50 μmol/L硒可以極顯著降低200 μmol/L鎘處理組胞內ROS含量（P＜0.01）。

2.6 硒對鎘處理組酵母細胞抗氧化酶活性及GSH含量的影響

在用超聲波破壁法制得粗提液后，按各試劑盒說明書測定各種抗氧化酶活性。本部分主要測定的幾種重要抗氧化酶，其中在測定GSH-Px的同時還對GSH含量變化進行了測定，結果見表1。

表1 不同處理對抗氧化酶活性及GSH含量的影響Table 1 Effects of different treatments on antioxidant enzyme activities and GSH and MDA contents in S. cerevisiae

與空白對照組相比，200 μmol/L鎘及50 μmol/L硒處理組酵母細胞SOD、CAT和GSH-Px活性均極顯著提高（P＜0.01），與鎘單獨處理組相比，200 μmol/L鎘和50 μmol/L硒共同處理組酵母細胞SOD、POD、CAT和GSH-Px活性提高，且對GSH-Px水平影響最大，與空白對照組相比相差10 倍以上。加硒后酵母細胞GSH含量極顯著升高（P＜0.01），鎘處理組GSH降低效應得到抑制。

2.7 硒對鎘處理組酵母細胞和MDA含量的影響

圖10 加硒對鎘誘導的MDA含量升高的影響Fig. 10 Inf l uence of adding selenium on cadmium-induced increase in MDA content

由圖10可以看出，與空白對照相比，添加200 μmol/L鎘極顯著升高釀酒酵母細胞內MDA含量（P＜0.01），達到了空白對照組的3 倍以上，添加50 μmol/L硒可以降低釀酒酵母細胞內的MDA含量，二者共同處理組MDA含量較鎘單獨處理組極顯著下降（P＜0.01），但與空白對照組相比較差異仍為極顯著（P＜0.01）；表明硒在降低釀酒酵母MDA含量方面有顯著的作用，且可以極顯著拮抗鎘引起的MDA含量升高。

3 結論與討論

機體在受到鎘的刺激后，體內會產生大量ROS[24]，使細胞和組織發(fā)生氧化損傷。SOD、CAT、GSH-Px和POD是釀酒酵母中的幾種重要抗氧化酶[15,25]，它們可以直接清除體內ROS，其中GSH-Px在清除過氧化物時需GSH源源不斷的補充才能充分發(fā)揮清除作用。膜系統(tǒng)中的不飽和脂肪酸極易被ROS氧化成MDA，因此MDA含量常作為判斷膜系統(tǒng)損傷程度的指標[26]。本實驗在選定200 μmol/L鎘和50 μmol/L硒作為處理濃度后，分別測定了SOD、POD、CAT、GSH-Px等重要抗氧化酶活性及GSH含量，還測定了ROS和MDA含量。

同其他學者研究結果相比，本實驗在添加200 μmol/L鎘后也同樣顯著（P＜0.05）抑制了釀酒酵母的生長，抑制率達到54.95%；并引起釀酒酵母ROS、MDA含量極顯著增加（P＜0.01），分別達到了空白對照組的5 倍和3 倍高的水平；不同于其他研究者實驗結果的是，本研究在添加鎘后未使釀酒酵母各抗氧化酶SOD、POD、CAT、GSH-Px活性顯著下降[15,27]，而是使得釀酒酵母各抗氧化酶活性均顯著（P＜0.05）增高，這可能是由于本研究選擇的鎘濃度較其他研究者要低[28]，而高濃度的鎘才會導致細胞抗氧化酶活性下降；同添加其他已知的外源抗氧化劑相同，添加硒后釀酒酵母幾種抗氧化酶活性均顯著（P＜0.05）提高，其中對GSH-Px和GSH含量的影響最大，這可能與GSH-Px是含硒抗氧化酶有關[29]；其ROS、MDA含量也均得到極顯著（P＜0.01）控制[15,30]，但并未能恢復到空白對照組的水平。說明硒可以通過提高細胞內SOD、POD、CAT和GSH-Px、GSH含量降低細胞內因氧化脅迫引起的ROS含量上升，降低釀酒酵母細胞MDA水平，進而拮抗鎘對釀酒酵母的氧化脅迫，這與張苗苗[31]、廖普興[32]等研究的在植物和動物體內的結果相一致。說明硒在釀酒酵母體內亦可對鎘產生拮抗作用，且與在動植物體內表現(xiàn)出一致的趨勢，因此可以利用釀酒酵母作為模式生物進一步研究硒對鎘毒性拮抗作用的一些機制。