周廣志，魯 敏，安華明*

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州省果樹工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025）

自由基和氧化脅迫可導(dǎo)致許多人類疾病的產(chǎn)生，包括老年癡呆癥、帕金森病、糖尿病、動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷以及衰老[1]，其致病機(jī)制是自由基誘導(dǎo)損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物分子[2-3]。據(jù)報道，以植物為主的飲食富含抗氧化劑可以降低氧化脅迫相關(guān)疾病的風(fēng)險[4]。而植物產(chǎn)品中的天然抗氧化劑已被證明可以作為自由基清除劑，防止在健康細(xì)胞中氧化損傷，而不會造成負(fù)面的影響，因此，這些天然抗氧化劑常被用來治療包括糖尿病、癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和炎性疾病[5-7]。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）屬薔薇科薔薇屬植物，因其果實風(fēng)味獨特和極高的營養(yǎng)價值而備受關(guān)注，近年來人們對其果實或提取物在醫(yī)學(xué)或營養(yǎng)保健上的作用以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)日趨重視。刺梨作為貴州省重點發(fā)展產(chǎn)業(yè)，其種植面積已超過1 000 km2，加工產(chǎn)品已有數(shù)十種。迄今已探明刺梨果實中含有VC、多種有機(jī)酸、氨基酸、酚類、黃酮類、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及三萜類等多種活性物質(zhì)[8-12]。這些活性物質(zhì)對于人體抗氧化反應(yīng)、清除體內(nèi)自由基并在抗衰老、抗輻射、消炎和抗腫瘤等過程發(fā)揮重要作用[13-14]。同時這些活性物質(zhì)本身在植物細(xì)胞內(nèi)就具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化力。比如VC在機(jī)體內(nèi)通過作為自由基清除劑、一些酶的輔酶、葉綠體和質(zhì)膜電子共體或受體等方面的作用而發(fā)揮其生物學(xué)活性[15]。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，主要是通過歧化反應(yīng)能夠催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，從而達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基、保護(hù)細(xì)胞的目的。酚類化合物是含羥基的芳烴衍生物，主要包括酚酸類、類黃酮類和單寧類等，具有清除自由基、提供氫原子或電子以及螯合金屬離子的能力，在人體內(nèi)能夠抑制腫瘤、抵抗誘變和改善人體微循環(huán)[16]。三萜類化合物是由倍半萜金合歡醇焦磷酸酯尾-尾縮合生成的鯊烯經(jīng)過不同的途徑環(huán)合而成的，具有抑制腫瘤、抗炎、抗菌、抗衰老等廣泛的生理活性[17]，研究表明該類物質(zhì)也是刺梨果實中的代表性成分之一[13]。正是以上這些物質(zhì)的復(fù)合作用，才使得刺梨果實具有廣泛的醫(yī)藥、保健和營養(yǎng)作用。

刺梨果實的活性物質(zhì)成分及其營養(yǎng)價值的研究雖豐富，但果實發(fā)育過程中這些活性物質(zhì)的變化特點及其與抗氧化活性的關(guān)系還不清楚。本實驗系統(tǒng)測定刺梨果實發(fā)育過程中總酚、總黃酮、總?cè)啤C及SOD 5 類主要活性物質(zhì)以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）和鐵離子還原（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）3 種抗氧化活性的變化特點，分析這些物質(zhì)對抗氧化能力的貢獻(xiàn)，對于了解刺梨果實抗氧化能力的組成特點、挖掘其醫(yī)藥保健價值以及品質(zhì)調(diào)控等都具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試刺梨材料為‘貴農(nóng)5號’刺梨果實，采于貴州大學(xué)刺梨種質(zhì)資源圃。用于實驗采樣的刺梨植株為50 株。果實發(fā)育期樣品于花后20 d開始取樣，以后每隔20 d定期隨機(jī)采取果實不少于100 g，直至果實成熟。以上樣品立即用液氮處理后保存于-75℃?zhèn)溆谩?/p>

福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、蘆丁、熊果酸（均為色譜級）、水溶性VE（Trolox）、DPPH、2,4,6-三吡啶吖嗪、ABTS 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B智能光照培養(yǎng)箱 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；UV-2100紫外分光光度計 上海優(yōu)尼柯儀器有限公司；BiofugeStratos臺式高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司；LC-15C液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨果實發(fā)育過程中主要活性成分的測定

1.3.1.1 總酚含量的測定

采用福林-酚法[18]測定，在提取液用量、顯色體積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線測定上略加改動。以標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸作為對照。每次稱取0.5 g樣品，加入15 mL 30%甲醇溶液，超聲提取50 min，超聲條件為50 ℃、40 kHz[19-20]，過濾，定容至50 mL，備用。吸取50 μL樣品加2.45 mL的蒸餾水，加0.2 mL福林-酚試劑、2.5 mL 20%碳酸鈉溶液定容至10 mL，2 h后于波長765 nm處測吸光度。

1.3.1.2 總黃酮含量的測定

參照羅峰[21]、吳媛琳[22]等的方法，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定，調(diào)整提取液用量和顯色體積。以標(biāo)準(zhǔn)蘆丁品作為對照。每次稱取0.5 g樣品，加入15 mL 30%甲醇溶液，超聲提取50 min，超聲條件為50 ℃、40 kHz[20]，過濾，定容至50 mL，備用。吸取2 mL提取液，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，加入0.6 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6 min，然后加入4 mL 4% NaOH溶液，用30%甲醇溶液定容至10 mL，搖勻放置15 min后于波長510 nm處測吸光度。各時期樣品按照上述處理方法至少重復(fù)3 次。按下式計算總黃酮含量：

式中：x為樣品中總黃酮含量/（mg/100 g）；m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測液中黃酮質(zhì)量/μg；v1為樣品中提取液測定用體積/mL；v2為樣品提出液總體積/mL；m為稱取的樣品質(zhì)量/g。

1.3.1.3 總?cè)扑岷康臏y定

采用香草醛-冰乙酸法，參照周巧霞[23]和張雁冰[24]等的方法并調(diào)整提取液用量。以標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸作為對照。每次稱取樣品0.5 g，加入15 mL 75%乙醇溶液，于50℃超聲提取50 min，提取液過濾，定容至50 mL搖勻備用。測定時提取液用量為0.2 mL，5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL，高氯酸1 mL，搖勻，置于60℃水浴中加熱20 min，立即置于冰水浴中冷卻，加冰乙酸10 mL搖勻，在波長545 nm處測吸光度。

1.3.1.4 VC含量測定

參考王樂樂等[25]的方法。提取時采用6%偏磷酸溶液5 mL在預(yù)冷的研缽中均勻研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，移取上清液至10 mL容量瓶中，剩余殘渣加提取液3～4 mL，相同條件離心10 min，移取并合并上清液，定容至刻度，搖勻后過0.45 μm濾膜即得用于測定的VC提取液。VC含量測定選用液相色譜法。色譜條件：Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.2%偏磷酸溶液；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.1.5 SOD活力測定

參考王學(xué)奎[26]的方法，采用氮藍(lán)四唑（nitrobluetetrazolium，NBT）法測定SOD活力。準(zhǔn)確稱取去除種子的刺梨果實0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加5 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（分開多次）研磨成漿，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為SOD粗提取液。于試管中依次加入3.0 mL 0.05 mol/L PBS，0.6 mL 130 mmol/L Met，0.6 mL 750 μmol/L NBT，0.6 mL 100 μmol/L EDTA-Na2，0.6 mL 20 μmol/L核黃素，0.1 mL酶液和0.5 mL蒸餾水。2支對照管用PBS代替酶液?；靹蚝髮?支對照置暗處，其他各管于4 000 lx日光條件下顯色反應(yīng)20 min，于波長560 nm處測吸光度。

1.3.2 動態(tài)發(fā)育過程中刺梨果實的抗氧化能力測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Li Xican等[27]的方法，在提取液用量、顯色體積上略加改動。每次稱取0.5 g樣品，加入15 mL 30%甲醇溶液，超聲提取50 min，超聲條件為50℃、40 kHz，過濾，定容至50 mL，備用。測定時吸取10 μL樣品提取液加到4 mL DPPH-甲醇溶液中，避光反應(yīng)20 min后在波長519 nm處測定吸光度，對照以相同體積的提取溶劑代替樣品提取液，最終結(jié)果以μmol/L Trolox等量抗氧化能力表示。

1.3.2.2 ABTS+·清除能力測定

參考Re等[28]的方法，在提取液用量、顯色體積上略加改動。每次稱取0.5 g樣品，加入15 mL 30%甲醇溶液，超聲提取50 min，超聲條件為50℃、40 kHz，過濾，定容至50 mL，備用。測定時吸取5 μL樣品提取液加到5 mL ABTS溶液中避光反應(yīng)10 min后在波長734 nm處測定吸光度，最終結(jié)果以μmol/L Trolox等量抗氧化能力表示。

1.3.2.3 FRAP測定

參照Benzie等[29]的方法，在提取液用量、顯色體積上略加改動。每次稱取0.5 g樣品，加入15 mL 30%甲醇溶液，超聲提取50 min，超聲條件為50℃、40 kHz，過濾，定容至50 mL，備用。測定時吸取3 μL樣品提取液加入FRAP溶液8 mL，37 ℃反應(yīng)10 min后在波長593 nm處測定吸光度，最終結(jié)果以μmol/L Trolox等量抗氧化能力表示。

3種體外抗氧化性評價方法中，均同時以0.1 g/mL的VC液代替提取液作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各樣品至少重復(fù)測定3次。采用Excel軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用DPS v7.05統(tǒng)計軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果實發(fā)育過程中主要活性物質(zhì)變化

如表1所示，其中V C含量隨果實發(fā)育呈持續(xù)上升趨勢，花后1 0 0 d達(dá)到最高含量為（1 192.85±17.99） mg/100 g。總酚和總黃酮含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中總酚含量在花后20 d含量最高，60 d降到最低，100 d又回升到最大值。而總黃酮含量前期（20～40 d）維持在最高水平，花后80 d降到最低，隨后有少量上升。與總酚和總黃酮相反，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，果實發(fā)育前期緩慢上升，花后40 d持續(xù)升高，并保持到60 d后再持續(xù)降低，直至達(dá)到最低值（100 d）。而總?cè)莆镔|(zhì)含量變化呈現(xiàn)先升高后降低再升高的特殊趨勢，果實發(fā)育前期迅速上升，花后40 d升到最高值，隨后迅速下降，80 d降到最低值，隨后（100 d）又迅速上升到最高水平。雖然刺梨最早是由于高含量的VC[30]而備受關(guān)注，但果實發(fā)育各時期總酚含量均高于VC，且有關(guān)研究證明總酚含量與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)[31]，這說明除了高含量的VC外，刺梨果實中高含量的總酚可能在主要活性物質(zhì)中起著更重要的作用。

表1 刺梨果實發(fā)育過程中主要活性物質(zhì)含量Table 1 Contents of main bioactive substances in Rosa roxburghii fruit during development

2.2 刺梨果實發(fā)育過程中的抗氧化活性變化

2.2.1 刺梨果實發(fā)育過程中DPPH自由基清除能力

圖1 刺梨果實發(fā)育過程中DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH free radical scavenging capacity in Rosa roxburghii fruit during development

根據(jù)吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系，可測得刺梨果實對自由基的清除能力。被測樣品如果能夠清除DPPH自由基，則可以據(jù)此推斷樣品具有減弱羥自由基、烷基自由基或過氧自由基的有效濃度和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用。如圖1所示，動態(tài)發(fā)育的刺梨果實DPPH自由基清除能力顯著高于VC。發(fā)育過程中刺梨果實DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，花后60 d的DPPH自由基清除能力最低（913.28 μmol/L），花后20 d（1 655.86 μmol/L）和100 d（1 463.27 μmol/L）果實的DPPH自由基清除能力是VC（110.18 μmol/L）的15 倍和13 倍。這是因為花后20 d和花后100 d的總酚、總黃酮含量極高，研究證明總酚、總黃酮與抗氧化密切相關(guān)，與有關(guān)研究[32]一致。

2.2.2 刺梨果實發(fā)育過程中ABTS+·清除能力

圖2 刺梨果實發(fā)育過程中ABTS＋·清除能力Fig. 2 ABTS free radical scavenging capacity in Rosa roxburghii fruit during development

如圖2所示，動態(tài)發(fā)育過程中的刺梨果實ABTS+·清除能力均顯著高于VC。同時花后20 d（1 172.12 μmol/L）刺梨果實的A B T S+·清除能力最強(qiáng)，是對照V C（150.89 μmol/L）的7.8倍，隨著果實發(fā)育，ABTS+·清除能力先降低，至花后60 d（590.53 μmol/L）時降到最低值，隨后快速升高，花后100 d（974.92 μmol/L）的果實表現(xiàn)出次高的ABTS+·清除能力，是對照VC（150.89 μmol/L）的6.7倍。這與DPPH自由基清除能力趨勢一致。

2.2.3 刺梨果實發(fā)育過程中FRAP

圖3 刺梨果實發(fā)育過程中FRAPFig. 3 FRAP free radical scavenging capacity in Rosa roxburghii fruit during development

刺梨果實可將Fe3+還原成Fe2+，其與FRAP試劑結(jié)合，在波長593 nm處具有最大吸收峰。如圖3所示，不同發(fā)育時期的刺梨果實FRAP均顯著高于VC。隨刺梨果實發(fā)育總還原能力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與DPPH自由基清除能力和ABTS+·清除能力呈現(xiàn)出一致性?；ê?0 d FRAP最低（1 783.56 μmol/L），而花后20 d（2 876.47 μmol/L）和花后100 d（2 708.86 μmol/L）表現(xiàn)出極強(qiáng)的FRAP，分別是對照VC（515.8 μmol/L）的5.8倍和5.3倍。

2.3 5 種活性物質(zhì)含量和抗氧化能力之間的相關(guān)性

如表2、3所示，總酚與抗氧化性能呈極顯著正相關(guān)，說明總酚是刺梨抗氧化能力的主要活性物質(zhì)，這與前人研究結(jié)果一致[33-34]?？傸S酮和總?cè)婆c抗氧化能力有一定的相關(guān)性，但不顯著，可能是因為刺梨果實中與總酚相比，總黃酮和總?cè)坪刻?。而由于果實動態(tài)發(fā)育過程中VC含量和SOD活性變化與3 種抗氧化能力呈相反趨勢，所以計算出的相關(guān)系數(shù)為負(fù)數(shù)（表2）。而如果以單個果實中的含量計算，則總酚、總黃酮、VC、總?cè)?、SOD均與3 種抗氧化能力呈（極）顯著正相關(guān)（表3）。

表2 刺梨果實活性物質(zhì)含量和抗氧化能力之間的相關(guān)性Table 2 Correlation between bioactive substance contents and antioxidant capacity in Rosa roxburghii fruit

表3 刺梨單果中活性物質(zhì)含量和抗氧化能力之間的相關(guān)性Table 3 Correlation between bioactive substance contents and antioxidant capacity in single Rosa roxburghii fruit

2.4 5 種活性物質(zhì)對抗氧化能力的貢獻(xiàn)

表4 5 種活性物質(zhì)的主成分分析Table 4 Principal component analysis of fi ve bioactive substances

如表4所示，其中因子1的代表性指標(biāo)為總酚和總黃酮含量，因子2的代表性指標(biāo)為VC含量，因子3的代表性指標(biāo)為總?cè)坪?，因?的代表性指標(biāo)為SOD活性。根據(jù)特征值大于1的原則提取2 個主成分，包含總酚、總黃酮和VC，它們的累計貢獻(xiàn)率約為82.20%，表明活性物質(zhì)對抗氧化能力的貢獻(xiàn)率較為集中；而選擇前3 個因子，其累計貢獻(xiàn)率能達(dá)到98.0%以上，幾乎反映了5 個活性物質(zhì)對抗氧能力貢獻(xiàn)的全部信息。前3 個因子的方差貢獻(xiàn)率分別為53.53%、28.67%、16.57%。5 種活性物質(zhì)對抗氧化能力貢獻(xiàn)的順序為總酚、總黃酮＞VC＞總?cè)疲維OD。

3 討論與結(jié)論

本研究以‘貴農(nóng)5號’刺梨果實為實驗材料，分析發(fā)育過程中刺梨果實總酚、總黃酮、總?cè)?、VC含量和SOD活性變化以及體外抗氧化活性。結(jié)果表明，動態(tài)發(fā)育過程中的刺梨果實活性物質(zhì)含量及3 種抗氧化能力變化差異顯著。VC含量隨果實發(fā)育持續(xù)增加，隨著果實成熟其含量達(dá)到最高；SOD活性在整個發(fā)育時期均維持在較高水平；而總酚、總黃酮和總?cè)坪孔兓疽恢?，均在幼果和成熟果中具有更高含量。整體上，幼果和成熟果具有較高的活性物質(zhì)含量和抗氧化能力，但花后20 d為果實發(fā)育初期，果實小，產(chǎn)量低，其利用率和利用價值也較低。成熟期果實各活性物質(zhì)含量豐富、抗氧化能力較強(qiáng)，綜合營養(yǎng)價值最高，是開發(fā)功能食品或醫(yī)藥保健產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原材料。

刺梨歷來以極高的VC含量著稱，雖然前期也發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力是多種物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果[12]，但人們自然認(rèn)為VC是其中的主要作用因子。對成熟果實中活性成分與抗氧化能力的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)總酚與總黃酮含量與DPPH自由基或羥自由基清除能力均呈不同程度正相關(guān)關(guān)系[32]。之前，對刺梨果實提取物中總酚和總黃酮含量及體外抗氧化能力的研究也發(fā)現(xiàn)它們與DPPH等自由基清除能力具有不同程度的一致性[33]。此外，在其他果實如蘋果[34]和枇杷[35-37]中也有類似的發(fā)現(xiàn)。本研究中，不同發(fā)育時期刺梨果實3 種抗氧化能力與總酚、總黃酮及總?cè)坪孔兓辔呛希揖c總酚含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；在已檢測的5類活性物質(zhì)中，總酚和總黃酮對抗氧化能力的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到50%以上，而VC和總?cè)频呢暙I(xiàn)率分別約為29%和17%，再次說明刺梨果實的抗氧化性能是幾類物質(zhì)共同作用的結(jié)果，而其中總酚和總黃酮發(fā)揮著非常重要的作用。本研究結(jié)果對于了解刺梨果實活性物質(zhì)的組成特點及其抗氧化能力具有重要的理論和實踐意義。