向健，楊立峰，田勝慧，曹穗蘭，鄭保婷

（廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 生物性能檢驗室，廣東 廣州 510080）

臨床上，對于骨的缺失或缺損，主要采取的治療方法包括自體骨移植、異體骨移植及人造材料填補。自體骨移植由于受骨量的限制，而且會伴隨新的創(chuàng)傷，在骨缺損面積較大時難以滿足臨床需求。而異體骨移植則有可能造成骨傳導、骨誘導能力降低[1]。因此，近年來臨床上越來越多的使用人造材料用于骨缺損的填充[2]。然而，對于如頜面骨等外形輪廓和解剖結構多樣又復雜的缺損部位，應用傳統(tǒng)工藝無法精確制備出與缺損部位完全匹配的修復體，這不但增加了術后引起并發(fā)癥的風險，還可能導致修復失敗[3-4]。而3D打印技術的興起，則為解決上述問題帶來了希望。本研究通過對一種由鈦合金經激光3D打印技術制備的骨修復體植入兔骨組織后的生物相容性進行探討，為后續(xù)進一步的安全性評價及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 新型3D打印骨修復體，材料為Ti-6A1-4V鈦合金。根據(jù)GB/T16886.6-2015《醫(yī)療器械生物學評價第6部分 ：植入后局部反應試驗》的規(guī)定制備成直徑2 mm，長6 mm的圓柱狀，表面經拋光處理并滅菌。

1.1.2 對照品 不銹鋼，直徑2 mm，長6 mm，圓柱狀，表面光滑并滅菌。

1.1.3 試驗系統(tǒng) 普通級新西蘭大白兔15只［動物來源：廣東省醫(yī)學實驗動物中心；實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002］，雌雄不限，雌性未產并無孕。實驗動物選擇理由：兔為常用實驗動物，體型較小，便于試驗操作，相關國家和國際標準均推薦采用家兔用于醫(yī)療器械骨植入試驗。動物采用單籠單只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合GB 14925-2010《實驗動物環(huán)境及設施》的要求。動物給予合格的兔維持配合飼料自由攝食，經自動供水系統(tǒng)給予合格生活飲用水。

1.2 方法

1.2.1 試驗前準備 使用30 g/L戊巴比妥鈉，按1 ml/kg的劑量經耳緣靜脈注射對動物進行麻醉。麻醉完成后對手術部位進行剃毛，隨后將動物綁定于手術臺上。采用75%乙醇和3%～5%碘町對手術部位進行消毒。

1.2.2 手術步驟 用手術刀逐層切開動物左側脛骨植入部位皮膚、皮下，分離組織，沿肌間隙暴露脛骨皮質，使用低轉速間歇在骨上鉆孔，鉆孔的同時用生理鹽水充分灌洗，以免過熱使局部組織壞死。鉆孔2個，間距1.5 cm，將樣品放置入鉆好的孔洞中，使樣品與骨組織盡量貼合緊密。植入后逐層縫合肌筋膜、皮下組織和皮膚，涂抹碘酒消毒，最后用滅菌紗布繃帶進行包扎。同法在動物右側脛骨植入2個對照品。

1.2.3 觀察 手術后定期觀察并記錄動物的健康狀況，包括植入局部、全身及行為活動是否有異常，1周后拆除縫合線。于植入后4周、12周、26周分別對5只動物施行安樂死，對植入部位正常組織結構進行肉眼觀察，并切取包括植入物及其周圍足夠多未受影響的組織制作組織病理切片，進行組織學評價。

1.2.4 評價方法 分別從炎性細胞類型/反應及組織反應兩方面進行記分（記分要求見表1和表2）。評價時，先根據(jù)表1和表2的規(guī)定，對每一動物植入物周圍組織的炎癥細胞反應程度及新血管形成程度、纖維化程度及脂肪浸潤程度等組織反應程度進行記分，計算出每一只動物試驗側組織炎性細胞分類的記分總和（A1）和組織反應的記分總和（A2）。然后計算每只動物試驗側的總分（A）：A=A1×2+A2，隨后計算5只動物試驗側的總記分并求出平均值。同法計算對照側的平均值，并按照表3判定反應程度。

表1 細胞類型/反應

表2 組織反應

表3 植入試驗結果判定

2 結果

2.1 臨床觀察

所有動物均按計劃實施手術，術后動物飲食規(guī)律，無異常表現(xiàn)。所有動物傷口愈合情況均良好，無明顯滲出，未觀察到傷口感染或干擾性創(chuàng)傷現(xiàn)象。

2.2 肉眼大體觀察

植入后4周、12周、26周均各取出包含植入物及周圍足夠未受影響的試驗側和對照側組織各10個。經肉眼觀察，植入物周圍組織無粘連、充血、水腫、壞死等異常情況。

2.3 顯微鏡觀察

顯微鏡下觀察可見：3D打印頜面骨修復體于骨植入4周后（見圖1），骨髓腔內可見圓形空腔，空腔周邊可見少量成骨組織及少量纖維組織囊形成；局部可見少量淋巴細胞浸潤；骨髓腔內可見較多脂肪組織和骨髓細胞。植入12周后（見圖2），植入局部炎癥反應明顯減輕，但仍可見少量淋巴細胞；骨髓腔內可見圓形空腔，空腔周邊可見由骨組織形成的包囊，少量纖維組織增生；骨髓腔內可見脂肪組織增生。植入26周后（見圖3），骨髓腔內可見圓形空腔，空腔周邊由骨組織形成的包裹明顯增厚，并少量纖維組織增生及脂肪組織。3D打印頜面骨修復體于骨植入4周、12 周及26周后的組織反應情況與同期對照側組織反應情況相比，無明顯差異。

圖1 3D打印頜面骨修復體骨植入后4周，HE染色

圖2 3D打印頜面骨修復體骨植入后12周，HE染色

圖3 3D打印頜面骨修復體骨植入后26周，HE染色

2.4 評價

根據(jù)表1和表2的記分要求對每個周期每只動物試驗側和對照側的骨組織反應情況進行記分，并參照本文1.2.4的半定量評價方法，評價不同植入周期植入物的組織反應程度，見表4。

表4 3D打印頜面骨修復體骨植入記分結果

3 討論

在骨缺失或缺損的臨床治療中，以往應用傳統(tǒng)工藝，難以制作出與缺損區(qū)域的形態(tài)、生物力學等特征完全匹配的修復體，且制作工藝復雜，耗時又耗費材料[5]。隨著3D打印技術的飛速發(fā)展，為上述難題的解決帶來了希望。3D生物打印是組織工程學的一種高速仿形技術，它以計算機三維設計模型為藍本，利用激光引導、噴墨打印等技術，將生物材料通過逐層堆積粘合，疊加塑型，最終形成仿真的組織或器官[6]。應用3D打印技術無需制作模具，就能在短時間內根據(jù)患者的骨缺損情況制作出個性化的、精度高的修復體。而用于3D打印骨缺損修復體的材料，其與骨組織的生物相容性是我們特別關注的，因為良好的生物相容性是評價材料生物安全性的重要組成部分，是決定其能否應用于臨床的先決條件[7-8]。

本研究依據(jù)GB/T16886.6-2015《醫(yī)療器械生物學評價第6部分：植入后局部反應試驗》的要求，對一種新型3D打印鈦合金骨修復體的骨組織生物相容性進行探討。在植入試驗中，不管是試驗材料還是對照材料，作為侵入機體的“異物”，均會引起不同程度的組織反應，其主要表現(xiàn)為：① 植入物周圍組織的炎癥反應程度及反應延續(xù)時間；②植入物周圍組織纖維囊腔的形成過程及最終厚度；③植入物周圍組織生物化學及組織化學改變及其延續(xù)時間等。這些反應可能與材料本身有關，也可能與手術操作方法及動物的個體差異等因素有關[9]。因此，在評價材料植入后的組織相容性時，需與經證實的陰性對照材料相比。本研究將3D打印鈦合金骨修復體通過手術操作植入到兔的脛骨，并于植入后4周、12周和26周取植入物及其相應組織進行肉眼大體觀察及顯微鏡觀察，最后采用半定量評價系統(tǒng)評價其骨組織反應程度。肉眼觀察結果顯示，在各植入周期，所有動物的試驗側和對照側植入部位均未出現(xiàn)粘連、充血、水腫、壞死等異常情況。進行顯微鏡下觀察時，可見在植入早期，試驗側和對照側植入物周圍均出現(xiàn)淋巴細胞浸潤，這可能由于植入物自身的微量小分子物質滲出刺激組織從而引起非感染性炎癥；也可能與手術創(chuàng)傷引起微生物侵入有關[10]。在植入12周后，這種炎癥反應明顯減輕。植入材料作為“異物”進入機體，還會引起機體對其進行包裹而形成被膜，以將正常組織與植入物隔開[11]。本研究中可見，在植入早期，植入物周圍便可見成骨組織和纖維細胞形成，隨著植入周期的延長，新生骨組織及纖維組織逐漸增多，使包裹植入物的囊腔逐漸增厚，這也表明植入材料有良好的成骨效應。

綜上所述，該新型3D打印鈦合金骨修復體具有良好的生物相容性，在骨缺損修復方面具有廣闊的發(fā)展和應用前景。目前，應用3D打印技術進行骨修復體的個性化制備已較為成熟，但對3D打印鈦金屬骨修復體的臨床前動物實驗研究和臨床研究仍較欠缺，希望本研究能為3D打印鈦金屬骨修復體后續(xù)進一步的安全性探討提供有限的實驗依據(jù)。