， ， ，仁英

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是多種心臟疾病發(fā)展至終末期的共同病理改變，可致心室順應(yīng)性和收縮功能下降而發(fā)生心力衰竭[1-2]。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CF)是MF的主要因素，MF主要是由于CF增殖和膠原蛋白的過(guò)量表達(dá)、分泌和堆積的結(jié)果[3]。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是目前公認(rèn)的促心肌纖維化因素，可引起CF增殖和膠原蛋白合成，從而導(dǎo)致心肌纖維化[4]。

金銀花(Lonicerae Flos)，又名雙花、忍冬花，為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，為常用中藥，藥用歷史悠久[5]。黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)為金銀花的有效成分之一，有研究表明黃酮類(lèi)化合物具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用，對(duì)冠心病、心絞痛、心血管疾病有較好效果[6-7]，但金銀花黃酮類(lèi)化合物對(duì)CF的增殖及其作用機(jī)制研究甚少。本研究觀察金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠CF的增殖及Ⅰ型膠原合成的影響，探討金銀花黃酮類(lèi)提取物抗MF的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生2 d～3 d的SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 金銀花藥材：購(gòu)自亳州市京皖中藥飲片廠(chǎng)，經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；血管緊張素Ⅱ(Sigma公司)；杜氏改良Eagle(DMEM)培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；胰蛋白-EDTA消化液(GIBICO公司)；二甲亞砜(Sigma公司)；Ⅰ型膠原蛋白一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；二抗羊抗兔IgG(美國(guó)LI-COR Biosciences)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯硫胺凝膠配制試劑盒和二辛可寧酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)；RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司)；引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒(日本同仁研究所)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AG135分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；組織勻漿機(jī)(德國(guó) IKA 公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)；CB150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder)；CKX41倒置顯微鏡(OLYMPUS)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó) Metertech公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciencesl)；電泳儀及電泳槽(北京六一廠(chǎng))；Heraeus Fresco 21低溫微量離心機(jī)(德國(guó)Thermo)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR)；Nano Drop 2000c 紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；普通RT-PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花黃酮類(lèi)提取物的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的金銀花50 g，粉碎過(guò)60目篩，加入70%乙醇500 mL，60 ℃水浴作用4 h，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)作用15 min(600 W，超聲1 s，間隙5 s)；60 ℃水浴，索氏回流提取器回流2 h；60 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 mL，提取物濃度相當(dāng)于1 g/mL，經(jīng)薄層層析檢驗(yàn)處于標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁黃酮類(lèi)相應(yīng)位置，紫外燈下顯相同熒光。115 ℃、15 min高壓滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 新生大鼠CF的分離、培養(yǎng) 取2 d～3 d的SD大鼠，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取出心室，采用預(yù)冷的D-Hanks液清洗，將其剪碎，用0.25%胰酶消化液反復(fù)消化(37 ℃恒溫?fù)u床搖動(dòng)10 min～15 min)，直至組織塊消失，收集每次消化上清液，加等量含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，離心棄上清，取沉淀加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，采用差速貼壁40 min，棄上清去除心肌細(xì)胞，獲得CF，待CF生長(zhǎng)接近融合90%時(shí)，胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)采用2代～4代CF。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共分為5組，空白對(duì)照組：含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基；AngⅡ模型組：含AngⅡ1.0×10-7mol/L；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量(200 μg/mL)組；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物中劑量(400 μg/mL)組；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量(600 μg/mL)組。

1.2.4 CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CF每孔1× 104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。吸各孔培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后取出96孔板，每孔加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)孵育30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光值(A)。

1.2.5 流式測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CF于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。吸棄各孔培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，去上清，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸潤(rùn)洗后，緩慢加入700 μL預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%，4 ℃固定4 h以上，1 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗2次，加入100 μL RNaseA(50 μg/mL)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL 碘化丙啶(50 μg/mL)，4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期，重復(fù)3次。

1.2.6 免疫印跡法(Western blot)測(cè)定相對(duì)蛋白表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CF于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。吸棄各孔培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，PBS輕輕洗滌2次，加入放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸法測(cè)定提取的蛋白濃度。加上樣緩沖液，100 ℃加熱煮沸7 min。每組取20 μg總蛋白上樣，利用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。三羥甲基丙氨酸緩沖液(TBST)洗滌3次，二抗室溫?fù)u床上慢速孵育1 h，TBST洗膜3次，利用Odyssey成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描分析，檢測(cè)各組細(xì)胞的蛋白條帶的灰度值，計(jì)算其相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.2.7 總RNA的提取 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，按照Trizol RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA。加入1 mL Trizol吹打使細(xì)胞滑落并充分裂解，靜置15 min；加入氯仿(Trizol：氯仿5∶1)，劇烈振蕩顛倒數(shù)次混勻，室溫靜置15 min。4 ℃，12 000 r/min 離心15 min。小心轉(zhuǎn)移上清液于無(wú)酶離心管中，加入與上清等體積的異丙醇上下顛倒混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r /min離心15 min，棄上清液，加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇，洗滌RNA。4 ℃，7 500 r /min離心10 min，重復(fù)1次。晾干至半透明，加入適量無(wú)核酸酶水-焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)量 取合格RNA樣品2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以oligo dT為引物，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后取同一批cDNA 5 μL用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。引物序列如下：β-actin上游引物5′-ACCTTCAACAACCCAGCCATGTACG-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAGGGTGG-3′；Ⅰ型膠原蛋白上游引物：5′-ATGGCTGCACGCACGAGTCACAC-3′，下游引物：5′-GTCTGGGGCACCAACGTCCA-3′。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共包含20 μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)結(jié)束后得到各組的目的基因和內(nèi)參的CT值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用ΔΔCT法分析RT-PCR所得數(shù)據(jù)，根據(jù)公式計(jì)算2-△△CT，(ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組)，計(jì)算得到mRNA的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。

2 結(jié) 果

2.1 金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)CF增殖的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：AngⅡ作用48 h后可顯著提高CF增殖率，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；金銀花黃酮類(lèi)提取物作用48 h后，與AngⅡ模型組比較，AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量、中劑量、低劑量組CCK-8的吸光度值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組與中劑量、低劑量組比較CCK-8的吸光度值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明金銀花黃酮類(lèi)提取物抑制CF的增殖作用具有一定的劑量依賴(lài)性。詳見(jiàn)表1。

表1 金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)大鼠CF增殖的影響

2.2 金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)CF周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：AngⅡ作用48 h后，AngⅡ模型組與空白對(duì)照組比較，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組與AngⅡ模型組比較，S期和G2/M期細(xì)胞所占比例呈劑量依賴(lài)性逐漸下降，G0/G1期細(xì)胞所占比例呈劑量依賴(lài)性逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組與中劑量組、低劑量組比較，S期和G2/M期細(xì)胞顯著下降，G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞各周期所占比例(±s) %

2.3 金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)CF中Ⅰ型膠原蛋白的影響 空白對(duì)照組、AngⅡ模型組和金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量、中劑量、低劑量組各組細(xì)胞內(nèi)的Ⅰ型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.445±0.040，0.670±0.030，0.414±0.030，0.354±0.020，0.216±0.030。AngⅡ模型組與空白對(duì)照組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量、中劑量、高劑量組與AngⅡ模型組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量顯著下降并呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組與中劑量、低劑量組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。

A為空白對(duì)照組；B為AngⅡ模型組；C為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量組；D為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物中劑量組；E為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01；與AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組比較，△P<0.01

2.4 金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)CF Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響 空白對(duì)照組、AngⅡ模型組和金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量、中劑量、低劑量組各組細(xì)胞內(nèi)的Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00，1.86±0.21，1.31±0.14，1.13±0.03，0.95±0.03。AngⅡ模型組與空白對(duì)照組比較，Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)量顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量、中劑量、高劑量組與AngⅡ模型組比較，Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)量顯著下降并呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組與中劑量、低劑量組比較，Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

A為空白對(duì)照組；B為AngⅡ模型組；C為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物低劑量組；D為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物中劑量組；E為AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與AngⅡ模型組比較，#P<0.01；與AngⅡ+金銀花黃酮類(lèi)提取物高劑量組比較，△P<0.01

3 討 論

MF主要表現(xiàn)為CF增殖、膠原沉積、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚集等，Ⅰ型膠原蛋白在心肌主要由CF合成和分泌，是MF乃至全身纖維化疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[8]。AngⅡ是CF的重要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子之一，它不僅可促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白合成增加，而且促進(jìn)CF增殖和Ⅰ型膠原蛋白合成增加，在促進(jìn)MF的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。MF是臨床多種心臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，導(dǎo)致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥[10]。因此，有效抑制CF增殖藥物將可有效阻斷此環(huán)節(jié)的發(fā)生，從而延緩或抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。

黃酮類(lèi)類(lèi)化合物為金銀花的有效成分之一，主要有木樨草素、葡萄糖苷、槲皮素、金絲桃苷等[11]。黃酮類(lèi)類(lèi)化合物具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用，對(duì)冠心病、心絞痛、心血管疾病有較好效果[12]，但金銀花中黃酮類(lèi)類(lèi)化合物對(duì)CF的增殖及其作用機(jī)制研究甚少，本研究通過(guò)觀察金銀花中金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠CF增殖及Ⅰ型膠原蛋白合成的影響，探討金銀花中金銀花黃酮類(lèi)提取物抗MF的作用及其機(jī)制。

本研究采用AngⅡ刺激體外培養(yǎng)的CF，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較AngⅡ明顯促進(jìn)CF增殖和Ⅰ型膠原蛋白的合成，具有促纖維化作用，這與徐朝軍等[13]報(bào)道相似，金銀花黃酮類(lèi)提取物可明顯抑制該作用。本研究結(jié)果顯示，金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。金銀花黃酮類(lèi)提取物可明顯增加CF的G0/G1期細(xì)胞百分率，降低S期和G2/M期細(xì)胞百分率，阻滯CF細(xì)胞周期。表明金銀花黃酮類(lèi)提取物通過(guò)抑制CF增殖和阻滯CF細(xì)胞周期從而抑制心肌纖維化。另一方面，AngⅡ誘導(dǎo)后CFⅠ型膠原蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增加，加入金銀花黃酮類(lèi)提取物作用后其表達(dá)顯著降低，且其抑制效應(yīng)隨著金銀花黃酮類(lèi)提取物作用劑量增加而加強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明金銀花黃酮類(lèi)提取物通過(guò)抑制CF的膠原合成抑制心肌纖維化進(jìn)程。

綜上所述，金銀花黃酮類(lèi)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠CF增殖和膠原合成具有明顯的抑制作用，具有抗纖維化作用，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。