，

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的基本病理基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變學(xué)異常和血小板活化是促使動脈粥樣硬化斑塊形成的危險因素[1]，因此，控制心腦血管疾病相關(guān)危險因素對防治心腦血管疾病具有重要意義。早期干預(yù)動脈粥樣硬化，可保護和穩(wěn)定粥樣斑塊，防止疾病進一步發(fā)展，降低發(fā)病率與死亡率[2]。本實驗旨在觀察血管軟化丸對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠血脂、血液流變學(xué)指標、血小板活化標志物CD63表達、主動脈粥樣斑塊病理形態(tài)及病灶處核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的影響，分析血管軟化丸防治動脈粥樣硬化的作用機制，為中醫(yī)藥在心腦血管疾病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ApoE-/-小鼠50只，SPF級，8周齡，體重18 g±2 g，雄性，購自南京大學(xué)動物研究所。另取具有相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組，SPF級，雄性，8周齡，體重18 g±2 g，購自中國科學(xué)院上海斯萊克實驗動物有限公司。所有動物由本院SPF級動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 血管軟化丸由山楂、神曲、萊菔子、陳皮、清半夏、茯苓、連翹、郁金、枸杞子、三七、珍珠、赭石組成，方中所有中藥均來自河南省中醫(yī)院藥劑科，選取道地藥材，并由醫(yī)院煎藥房按照要求煎煮和濃縮成濃度為3.456 g/mL溶液。辛伐他汀[規(guī)格：每片20 mg，廣州南新制藥有限公司(批號20130607)]；硫酸氫氯吡格雷片[規(guī)格：每片25 mg，深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司(批號20131230)]，并根據(jù)成人臨床常規(guī)用量等效換算為小鼠用量。

1.3 造模與給藥 所有小鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，C57BL/6J小鼠給予普通飼料，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)；各組均予以自由飲水。于飼養(yǎng)4周后隨機選取兩只ApoE-/-小鼠取材主動脈，發(fā)現(xiàn)有動脈粥樣硬化斑塊形成動脈粥樣硬化提示造模成功，造模成功后將48只ApoE-/-小鼠按照隨機分組方法分為4組，每組12只，于12周齡起，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃；中藥組給予血管軟化丸86.4 g/(kg·d)；辛伐他汀組組給予辛伐他汀片，按照3 mg/(kg·d)灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷片，按照14 mg/(kg·d)灌胃。灌胃量為每日0.4 mL。實驗過程每周稱體重2次，根據(jù)體重調(diào)整藥物劑量。

1.4 樣品采集與處理 動物處死前禁食12 h，經(jīng)眼眶采血，分離血清。脫頸椎處死，分離主動脈，用10%多聚甲醛固定6 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋處理后切片。

1.5 標本檢測

1.5.1 生化指標測定 采用大型生化檢測儀檢測各組小鼠血脂水平，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)使用酶比色法；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)使用直接測定法，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)根據(jù)Fricdwald公式計算：LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.5.2 血小板CD63表達水平的測定 收集外周血血小板，分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)連接的抗鼠CD63抗體，4 ℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS Buffer洗滌3次后，應(yīng)用BD-LSR流式細胞儀檢測CD63陽性血小板。

1.5.3 血液流變學(xué)指標測定 全血黏度測定溫度37 ℃，設(shè)低切、中切、高切3個切變率；同時檢測血漿黏度和紅細胞聚集指數(shù)。

1.5.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 將主動脈經(jīng)10%甲醛緩沖液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5.5 NF-κB測定 病灶處NF-κB含量測定采用免疫組化法。結(jié)果分析應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)，各組每張切片隨機測定5個視野，測定細胞平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 實驗完成情況 飼養(yǎng)和灌胃過程中ApoE-/-小鼠死亡2只，C57BL/6/J小鼠死亡1只；剔除離群值，最后進入統(tǒng)計的各組小鼠數(shù)量均為10只。

2.2 各組小鼠血脂代謝水平比較 與正常對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥組和辛伐他汀組血清TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與氯吡格雷組比較，中藥組和辛伐他汀組血清TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組與辛伐他汀組血脂水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。氯吡格雷組與模型組血脂水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠血脂代謝水平比較(±s) mmol/L

2.3 各組小鼠血液流變學(xué)指標比較 與正常對照組比較，模型組和辛伐他汀組小鼠血液流變學(xué)指標明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥組和氯吡格雷組全血黏度與血漿黏度明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與辛伐他汀組比較，中藥組和氯吡格雷組全血黏度與血漿黏度明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血液流變學(xué)指標比較(±s)

2.4 外周血血小板表面CD63表達 各組小鼠血小板表達CD63流式細胞檢測結(jié)果：血小板CD63表達水平模型組(54.85±14.94)%、辛伐他汀組(54.79±13.98)%、氯吡格雷組(33.42±9.31)%、中藥組(32.83±9.22)%、正常對照組(15.91±7.02)%，依次降低；模型組明顯高于正常對照組、氯吡格雷組和中藥組(P<0.05)；氯吡格雷組和中藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P>0.05)。詳見圖1。

A：正常對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：氯吡格雷組；E：中藥組

2.5 各組小鼠主動脈病理形態(tài)觀察 光學(xué)顯微鏡(×200)觀察可見，正常對照組：小鼠主動脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜光滑平整，內(nèi)膜、中膜及外膜清晰，各層結(jié)構(gòu)正常，無動脈粥樣硬化病灶(見圖2 A)。模型組：光鏡下可見動脈管腔不平，管腔內(nèi)膜顯著增厚、彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清；中膜平滑肌明顯萎縮、細胞排列紊亂，病灶表面由纖維細胞、膠原纖維構(gòu)成薄的纖維帽；管壁厚度、斑塊截面積顯著大于正常組(見圖2 B)。辛伐他汀組：病變主動脈管腔狹窄，內(nèi)膜增厚，有局限性泡沫細胞形成，病灶表層纖維帽較薄，病變程度明顯較模型組減輕(見圖2 C)。氯吡格雷組：病變主動脈管腔狹窄，內(nèi)膜增厚，有局限性泡沫細胞形成及單核細胞黏附；中膜平滑肌厚度均勻，平滑肌細胞排列稍有紊亂，病變程度明顯較模型組減輕(見圖2 D)。中藥組：各層結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，局部有小灶性的鈣化顆粒物沉積，病變輕，斑塊小，泡沫細胞和脂質(zhì)減少，彈力板基本完整，病變程度明顯輕于模型組，并較氯吡格雷組輕(見圖2 E)。

A：正常對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：氯吡格雷組；E：中藥組

2.6 血管軟化丸對ApoE-/-小鼠動脈壁粥樣斑塊及周圍血管壁NF-κB的影響 光學(xué)顯微鏡(×400)觀察可見：與正常對照組比較，模型組、辛伐他汀組、氯吡格雷組和中藥組小鼠斑塊及血管內(nèi)、中、外膜細胞染色呈強陽性。各給藥組小鼠主動脈斑塊出現(xiàn)不同程度的染色強陽性，中藥組平均光密度值較辛伐他汀組明顯減小。詳見圖3、圖4。

A：正常對照組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：氯吡格雷組；E：中藥組

與模型組比較，*P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與氯吡格雷組比較，▲P<0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化是一個與內(nèi)皮細胞損傷、脂質(zhì)紊亂、血流動力學(xué)異常有關(guān)的、極其復(fù)雜的慢性炎癥過程[3]?，F(xiàn)有學(xué)說不能較好地概括動脈粥樣硬化的病理機制，該病發(fā)病機制和病理復(fù)雜性給臨床治療和預(yù)防帶來一定困難。有研究認為，動脈粥樣硬化病理機制動態(tài)演變在某種程度上與血小板活化有關(guān)，也有學(xué)者認為調(diào)控細胞黏附分子NF-κB是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動機制之一[4-6]。有研究表明，機體靜止血小板受到刺激劑作用或與受損的血管壁、血管外組織接觸時可激活成為活化血小板，其外形發(fā)生改變并產(chǎn)生黏附、聚集和釋放反應(yīng)，血小板活化后可分泌多種導(dǎo)致動脈粥樣硬化介質(zhì)，如細胞因子、趨化因子、生長因子、黏附分子與凝血因子[7-10]。

中醫(yī)藥以整體觀為指導(dǎo)，多靶點整合起效，毒副作用小，對復(fù)雜疾病的治療具有獨特優(yōu)勢。本研究結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論及前期臨床調(diào)查，認為氣虛痰瘀證候是冠心病、動脈粥樣硬化的主要證型，并提出益氣活血、化痰降濁的治療大法，由此形成基本方藥血管軟化丸。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床研究，認為痰瘀阻滯是動脈粥樣硬化的主要證型，基于動脈粥樣硬化病因病機特點，全國名老中醫(yī)李鯉教授研制出血管軟化丸，已在臨床應(yīng)用近20年，用于預(yù)防和治療缺血性心腦血管疾病，動脈粥樣硬化，高脂血癥和高黏血癥，臨床療效可靠[11-12]。該方由山楂、建曲、萊菔子、陳皮、清半夏、茯苓、連翹、郁金、枸杞子、三七、珍珠、赭石等12味中藥組成。方中山楂消一切飲食積滯，尤長于消肉食油膩之積，為君藥；神曲消食健胃，長于化酒食陳腐之積；萊菔子下氣消食除脹，長于消谷物面食之積；半夏，茯苓健脾燥濕化痰；郁金、三七行氣散結(jié)，活血化瘀；枸杞滋補肝腎；珍珠母、代赭石平肝潛陽降逆祛痰，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰“代赭石能止血，兼能涼血，其質(zhì)重墜，又善鎮(zhèn)逆氣，降痰涎……”共為臣藥；陳皮理氣和中，取其“治痰先理氣，氣順則痰消”之意，為佐藥；甘草健脾和中，調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀、平肝潛陽之功，使痰瘀同治，血行痰清，氣血流通。

本實驗觀察血管軟化丸對ApoE-/-基因敲除小鼠血脂、血液流變學(xué)指標、血小板活化標志物CD63表達，主動脈粥樣斑塊病理形態(tài)及病灶處NF-κB的影響，探討血管軟化丸防治動脈粥樣硬化的作用機制。結(jié)果顯示：高脂飲食可造成動物血脂及血液流變學(xué)指標顯著升高，可引起ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊形成。血管軟化丸可明顯降低高脂血癥小鼠TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C；顯著降低全血低切、中切、高切黏度，血漿黏度，紅細胞聚集指數(shù)。各組小鼠主動脈斑塊出現(xiàn)不同程度的染色強陽性，中藥組平均光密度值較正常對照組明顯降低，表明血管軟化丸通過調(diào)控高脂飲食引起的脂代謝紊亂及血液流變學(xué)指標異常，降低血小板活化標志物CD63表達和周圍血管壁NF-κB含量，起到抗動脈粥樣硬化的作用。