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        楊樹銹病病原菌的分子鑒定及防治措施

        2018-11-26 07:37:56莫丁山
        商情 2018年46期
        關(guān)鍵詞:防治技術(shù)

        莫丁山

        【摘要】青楊鑄病是互助縣楊樹人工林和天然林的重大病害之一,在純林或落葉松混交林中均普遍發(fā)生并造成嚴重的經(jīng)濟損失,該研究對互助縣南門峽林場楊樹銹病病原菌進行了分子鑒定,為明確其正真的病原菌種類并總結(jié)了防治措施。

        【關(guān)鍵詞】楊樹 銹病 分子鑒定 防治技術(shù)

        1 病害調(diào)查

        2015-2017年,在互助縣南門峽林場選取10塊標準地,7~10月每隔1月調(diào)查一次青楊銹病發(fā)病率與病情指數(shù)。標準地的設(shè)置為每塊標準地面積約為30×30m2,每塊標準地內(nèi)隨機選4~5行青楊,各行再每隔3株選取1株,隨機摘取上、中、下三個部位青楊葉片,總調(diào)查30~50株,葉片總數(shù)不少于800片;對于散生的青楊,依據(jù)實際分布情況隨機選取調(diào)查株。青楊銹病病害嚴重度分級參照曹支敏等的分級標準,見表1。

        經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),青楊銹病主要危害青楊苗木和新生葉片,導(dǎo)致未成熟芽早落,該病害于5-6月在葉背出現(xiàn)退綠斑點并產(chǎn)生夏孢子堆,并產(chǎn)生桔黃色小泡,破皮后散出黃粉堆,嚴重時黃粉布滿整個葉背,9月,葉正面出現(xiàn)銹紅色斑點,并逐漸變成棕色至褐色的冬孢子堆,葉子提前脫落,樹木長勢變?nèi)跻资芷渌≡锴秩尽?/p>

        2 病原菌分子鑒定

        2.1 夏孢子DNA提取

        取夏孢子DNA,用滅菌載玻片刮取新鮮夏孢子堆于滅菌研缽中研磨,置于1.5mL離心管內(nèi),具體加樣步驟如下:①加20μl的Lysozyme溶液,混合,室溫靜置6min;②加30μl的EDTA Buffer,混合,室溫靜置5min;③加200μl的Solution A,振蕩,65℃保溫10min;④加400μl的Solution B,劇烈振蕩15S;⑤加650μl的So-lution C,混合;12,000rpm離心1min,棄上層,將無色下層移人預(yù)先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中,12,000rpm離心1min。⑥棄Filter Cup,在濾液中加入450μl的DB Buffer,混合均勻。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。⑦將上述操作的混合液轉(zhuǎn)移至Spin Column中,12,000rpm離心1min,棄濾液。⑧將500μl的Rinse A加入至Spin Column中,12,000rpm離心1min,棄濾液。將700μl的Rinse B加入至Spin Column中,12,000rpm離心1min,棄濾液。⑨將Spin Column安置于CollectionTube上,12,000rpm離心1min。⑩將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1min。12,000rpm離心1min洗脫DNA。

        2.2 PCR擴增及擴增產(chǎn)物電泳檢測

        擴增引物為:ITS1-F和ITS4-B GardesM、B runs T D。

        反應(yīng)體系為:2μL摸板DNA、36.5μL ddH2O、2μL MgCl2(25mm ol L-1)、5μL10×PCR Buffer,0.5μLdNTPS(10mm olL-1)、1μL⑩ITSI-F(10μm of L-1)、1μL ITS4-B(10μm of L-1)、4U Taq酶(生工)。

        反應(yīng)條件:61℃1′15″,93℃1min,55.3℃1′15″,72℃1′30″,30cycles,72℃ 10min,4℃保存。反應(yīng)前將底物在95℃溫育5min,然后迅速置-20℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,并成像。

        2.3 rDNA-ITS序列測序及同源性比對

        以夏孢子的ITS1和ITS4區(qū)擴增產(chǎn)物進行全序列測定(金唯智生物科技(北京)有限公司),并將獲得的DNA序列在NCBI上進行比對。將rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物進行測序,所得結(jié)果比對,結(jié)果顯示與Melampsora larici-populina序列同源性為99%。rDNA-ITS序列長度為663bp?;贜ei's(1978)構(gòu)建無偏遺傳距離的系統(tǒng)樹狀圖,系統(tǒng)樹狀圖顯示實驗種與Melampsora larici-populina(DQ234698) ITS序列聚為一類,同源性為99.8%。明確該菌為落葉松楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)。

        3 防治技術(shù)

        青楊林是一個生態(tài)經(jīng)濟系統(tǒng),對楊樹病害的防治不能孤立地、片面地進行,而應(yīng)從楊樹林生態(tài)系統(tǒng)的總體出發(fā),以預(yù)防為主,有機地運用林業(yè)、生物、化學等綜合防治措施,達到有效地控制病害的目的。

        3.1 有效的預(yù)防措施

        在有條件的地方增施一些磷(P)、鉀(K)肥,控制氮(N)肥,提高林木抗病力,在田間管理上,應(yīng)注意及時清除帶病落葉,減少病菌的侵染來源。另外,由于夏孢子大多降落在離其發(fā)生處300米的范圍內(nèi),青楊育苗區(qū)應(yīng)選擇遠離發(fā)病區(qū)300米以外的安全地帶,防止大面積青楊林的病菌孢子擴散傳播到苗圃,減少苗木發(fā)病。

        3.2 化學防治措施

        防治楊樹銹病應(yīng)在早春用藥,避免傳播。早春時及時發(fā)現(xiàn)顏色鮮艷并存在畸形生長的芽,摘除病芽,并及時銷毀,對防止夏孢子擴散侵染效果十分顯著,可大大降低銹病發(fā)病率。也可以在早春階段,采取摘除病芽和藥劑防治相結(jié)合的防治手段,控制病害發(fā)生。對已發(fā)病的苗圃,可噴灑50%多菌靈800倍液,對已發(fā)生銹病的幼樹和大樹,在發(fā)病初期,可噴灑50%代森銨水劑100倍液、退菌特500~1000倍液、25%三唑酮可濕性粉劑1000倍液,或噴灑0.3~0.4度石硫合劑,有一定的效果。發(fā)生嚴重時,應(yīng)在第一次用藥后15~20天噴第二次,連噴2~3次。

        3.3 選育抗性品種

        目前也發(fā)現(xiàn)了一些與楊樹抗病性相關(guān)的基因或分子標記,而采用分子標記定位抗性基因和構(gòu)建抗病基因連鎖遺傳圖譜技術(shù),結(jié)合傳統(tǒng)抗病選種育種方法,正成為楊樹抗病育種先進模式。

        參考文獻:

        [1]Hansen E A.Poplar woody biomass yields:a look to the future[J].Biomass&Bioenergy;,1991,1(1):1-7.

        [2]Heilman P E,F(xiàn)ogle D,Ekuan G.Above-and beleow-ground bi-omass and fine roots of 4-year-old hybrids of Populus trichocarpa*XB Populus deltoides[J].Canadian Journal of ForestResearch,1994.

        [3]北京林學院.林木病理學[M].中國林業(yè)出版社,1981.

        [4]岳曉麗.花椒對鞘銹菌的固有抗病性研究[D].西北農(nóng)林科技大學,2010.

        [5]曹支敏,田呈明,梁英梅.花椒銹病流行規(guī)律及藥劑防治研究[J].林業(yè)科技通訊,1991(5).

        [6]Gardes M,Bruns T D.ITS primers with enhanced specificity forbasidiomycetes——application to the identification of mycorrhizaeand rusts[J].Molecular Ecology,2010,2(2):113-118.

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