張毅強(qiáng)， 師帥帥， 裴晉紅， 鄭 軍， 王星宇， 李云飛， 于 波， 張慧鵬， 胡文慶△

(1長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生化教研室， 山西 長(zhǎng)治 046000； 2長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科， 山西 長(zhǎng)治 046011；3長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院臨床一系， 山西 長(zhǎng)治 046000； 4長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院普外科， 山西 長(zhǎng)治 046011)

G-四鏈體(G-quadruplex，G4)是由富含鳥(niǎo)嘌呤的序列通過(guò)Hoogsteen氫鍵相連形成的一種非經(jīng)典的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。研究表明該二級(jí)結(jié)構(gòu)廣泛存在于DNA及RNA中，與基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[2]，參與腫瘤與某些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，具有重要的生物學(xué)功能，已成為抗腫瘤研究的重要靶點(diǎn)[3-4]。端粒是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)，由富含TG序列的多次重復(fù)組成[5]，位于端粒區(qū)的富含G的序列可以形成G4結(jié)構(gòu)[6-7]。

本課題前期研究已成功構(gòu)建了G-四鏈體DNA的單鏈抗體原核表達(dá)載體pSANG10-BG4，并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)及鑒定了該抗體BG4[8]，但BG4在真核細(xì)胞內(nèi)的功能并未研究。由于在真核細(xì)胞端粒區(qū)存在大量的G序列，因此本研究擬進(jìn)一步構(gòu)建并鑒定BG4真核表達(dá)載體，分析胃癌細(xì)胞株AGS中表達(dá)的BG4對(duì)其端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

大腸桿菌DH5α、pEGFP-N1和胃癌細(xì)胞株AGS為本室留存；pMDTM18-T Vector Cloning Kit(6011)、Gene Mark Plasmid Miniprep Purification KitⅡ(DP012)、 EX Taq DNA聚合酶(RR001A)、dNTP Mixture(4030)及限制性內(nèi)切酶SacⅠ(1078S)和PstⅠ(1073S)購(gòu)于TaKaRa;DNA Marker(SM0331)和T4 DNA Ligase(2011A)購(gòu)自Thermo; MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762)、1 kb DNA Ladder(3426A)、TRANS 100bp DNA ladder(BM301)購(gòu)于TaKaRa;蘇木素伊紅染色試劑盒(AR-0781)購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)于OXOID；抗FLAG兔多克隆抗體(RG001060)購(gòu)自索萊寶公司；抗人TERT(human TERT,hTERT;sc-7212)和β-actin (sc-4778)抗體購(gòu)自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗(D110058)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；其余試劑選用國(guó)產(chǎn)分析純。引物序列及測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2 方法

2.1PCR擴(kuò)增BG4序列 根據(jù)pSANG10-BG4中BG4的序列，設(shè)計(jì)BG4引物，上游引物序列為5’-GGAGCTCATGGCCGAGGTGCAGCTG-3’，下游引物序列為5’-CTGCTGCAGCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC-3’，下劃線表示SacⅠ與PstⅠ酶切位點(diǎn)，其5’端序列為保護(hù)堿基。反應(yīng)體系：滅菌去離子水36.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，上游引物(10 μmol)1 μL，下游引物(10 μmol)1 μL，pSANG10-BG4 DNA 1 μL，總體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min。恒壓120 V，跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳45 min，記錄拍照。

2.2pMD18-T-BG4載體的構(gòu)建及序列測(cè)定 取滅菌去離子水3 μL、上述純化的PCR產(chǎn)物1 μL、pMD18-T載體1 μL和Ligation solutionⅠ 5 μL，16 ℃反應(yīng)1 h。挑取平皿中生長(zhǎng)的白色單克隆菌落溶解在含Kana的新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，取2 μL菌液為模板進(jìn)行PCR；擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ與PstⅠ酶切鑒定，反應(yīng)體系為：滅菌去離子水12 μL，10× QBuffer 5 μL，pMD18-T-BG4質(zhì)粒1 μL，SacⅠ1 μL，PstⅠ1 μL，總體積20 μL。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像儀記錄結(jié)果。選取經(jīng)雙酶切鑒定成功與預(yù)期結(jié)果一致的菌株送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，以最終確定重組真核質(zhì)粒的正確性。

2.3pEGFP-N1-BG4載體的構(gòu)建及鑒定 小量提取pMD18-T-BG4質(zhì)粒，經(jīng)SacⅠ和PstⅠ雙酶切后回收含有黏性末端的小片段，反應(yīng)體系為：滅菌水21 μL，pMD18-T-BG4質(zhì)粒20 μL，10× QBuffer 5 μL，SacⅠ 2 μL，PstⅠ 2 μL，總體積50 μL。pEGFP-N1轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)SacⅠ和PstⅠ雙酶切，切膠回收大片段，方法同上，反應(yīng)體系為：回收的pEGFP-N1載體大片段1 μL，純化目的片段16.6 μL，T4 DNA連接酶0.4 μL，10× T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，總體積20 μL。提取質(zhì)粒pEGFP-N1-BG4經(jīng)SacⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定及SacⅠ單酶切鑒定，選取經(jīng)雙酶切鑒定成功的菌株送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，以最終確定重組真核質(zhì)粒的正確性，并命名為pEGFP-N1-BG4。

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染分為空白對(duì)照(control)組(未加質(zhì)粒及LipofectamineTM2000)、pEGFP-N1組及pEGFP-N1-BG4組將AGS細(xì)胞按每孔1×106接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，按LipofectamineTM2000說(shuō)明配好A、B液。A液含240 μL 無(wú)血清無(wú)抗生素RPMI-1640培養(yǎng)基和10 μL LipofectamineTM2000，總體積250 μL，室溫孵育5 min；B液含雙無(wú)RPMI-1640培養(yǎng)基及4.0 μg 去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，總體積250 μL?；旌螦、B液室溫避光孵育20 min。將混合液逐滴加入孔中，每孔培養(yǎng)基總量為2 mL，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。培養(yǎng)6 h后，將孔內(nèi)培養(yǎng)基換為完全RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)，分析轉(zhuǎn)染效果。

2.5Western blot鑒定BG4蛋白表達(dá) pEGFP-N1-BG4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，吸凈PBS，孔內(nèi)加入150 μL RIPA，置冰上20 min，待充分裂解后，12 000×g、 4 ℃離心5 min，取上清，行SDS-PAGE分離待測(cè)蛋白，I 抗用抗FLAG-Tag于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min。HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗按1 ∶5 000的比例稀釋于5%脫脂奶粉中，室溫下孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光液顯色。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，PBS洗3次，預(yù)冷的乙醇固定2 h，PBS洗去固定液，細(xì)胞沉淀中加 100 μL RNase A 溶液，重懸細(xì)胞，37 ℃水浴 30 min；再加入400 μL PI 染色液混勻，4 ℃避光孵育 30 min。于激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm 處記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.7DAPI 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將6孔板內(nèi)接種的AGS細(xì)胞分為空白對(duì)照(control)組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1-BG4組，轉(zhuǎn)染24 h后，PBS洗3次，每次2 min。每孔加入100 μL DAPI，室溫染色5 min。吸除DAPI 染液，PBS洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.8HE染色 細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌2次，每次2 min。蘇木素染10 min，自來(lái)水洗滌10 min，蒸餾水洗1次，1%氨水中返藍(lán)2 min，自來(lái)水洗干凈，95%乙醇5 s，伊紅染液染1 min，70%乙醇洗2次，拍照觀察。

2.9qPCR及Western blot測(cè)定hTERT表達(dá) TRIzol法提取3組細(xì)胞總RNA，按TaKaRa公司Prime ScriptTMRT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR? Premix Ex TaqTMII體系進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定3組hTERT的表達(dá)。hTERT的上游引物序列為5’-GGAGGCTCGTGGAGACCATC-3’, 下游引物序列為5’-CATTTGCCAGTAGCGCTGGG-3’; β-actin的上游引物序列為5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’, 下游引物序列為5’-GGGCCGGACTCGTCATAC-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，提取細(xì)胞總蛋白，濃度測(cè)定后進(jìn)行Western blot檢測(cè)各組hTERT的蛋白表達(dá)(方法如前所述)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pMD18-T-BG4和pEGFP-N1-BG4載體的構(gòu)建、鑒定和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以pSANG10-BG4質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯示擴(kuò)增得到的BG4目的片段位于800～900 bp，與理論結(jié)果877 bp一致，無(wú)非特異擴(kuò)增帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。

PCR擴(kuò)增BG4基因片段純化回收后與pMD18-T載體進(jìn)行連接，可見(jiàn)陽(yáng)性菌落，將陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒進(jìn)一步用SacⅠ和PstⅠ雙酶切，可見(jiàn)載體pMD18-T和目的片段BG4 2個(gè)條帶，表明質(zhì)粒連接正確，送測(cè)序并將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-BG4。

pEGFP-N1-BG4載體經(jīng)SacⅠ和PstⅠ雙酶切，結(jié)果出現(xiàn)的條帶與預(yù)期的877 bp的小片段和4.7 kb的大片段相符合。經(jīng)SacⅠ單切條帶位于5 000～6 000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果一致。pEGFP-N1-BG4測(cè)序顯示插入片段序列與BG4序列完全一致，表明載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The sequencing results of pEGFP-N1-BG4 recombinant plasmid (partial).

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后觀察EGFP在AGS細(xì)胞中的表達(dá)，空白對(duì)照組無(wú)EGFP表達(dá)，而pEGFP-N1組和pEGFP-N1-BG4組可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖2。圖中可見(jiàn)pEGFP-N1 組綠色熒光蛋白表達(dá)量較pEGFP-N1-BG4多，可能是因?yàn)閜EGFP-N1-BG4質(zhì)粒較大。

Figure 2. EGFP expression in vitro imaging of AGS cells 24 h after gene transfection. A and B: pEGFP-N1 group; C and D: pEGFP-N1-BG4 group.

2 Western blot檢測(cè)BG4的蛋白表達(dá)

pEGFP-N1-BG4組可見(jiàn)BG4蛋白的表達(dá)，BG4蛋白的分子量為30～35 kD，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白分子量為27 kD，融合蛋白分子量為57～62 kD，目標(biāo)蛋白分子量介于48～63 kD之間，與理論值相符。結(jié)果表明AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BG4質(zhì)粒成功表達(dá)BG4蛋白，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The image of Western blot analysis for determining the expression of BG4 fusion protein in the AGS cells. M: standard molecular weight protein marker; A: proteins from the AGS cells transfected by pEGFP-N1-BG4 vector; B: proteins from the AGS cells transfected by pEGFP-N1 vector.

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

與空白對(duì)照組及pEGFP-N1組相比，pEGFP-N1-BG4 組可使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S 期(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Flow cytometry analysis for cell cycle distribution.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group.

4 DAPI 法及HE染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

空白對(duì)照組及pEGFP-N1組細(xì)胞核染色均一，表面光滑，圓形或類圓形；pEGFP-N1-BG4組細(xì)胞核輪廓不規(guī)則，出現(xiàn)偏位及新月形改變，出現(xiàn)核固縮的凋亡表現(xiàn)，見(jiàn)圖5。

5 qPCR及Western blot測(cè)定hTERT的表達(dá)

qPCR結(jié)果表明，與control組相比，hTERT的mRNA表達(dá)在pEGFP-N1-BG4 組受到抑制(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，與control組相比，pEGFP-N1-BG4 組hTERT表達(dá)降低(P<0.05)，與hTERT mRNA結(jié)果一致?？瞻讓?duì)照組與pEGFP-N1 組比較 hTERT在mRNA和蛋白水平上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

Figure 5.Detection of apoptosis by DAPI method (upper panel, ×200) and morphological observation (lower panel, ×400).

Figure 6.qPCR (A) and Western blot (B) analysis of the expression of hTERT. Mean±SD. n=3.* P<0.05 vs control group.

討 論

G4結(jié)構(gòu)廣泛存在于端粒及基因的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[9-11]。Fernando等[12]在2009年即提出針對(duì)DNA G4結(jié)構(gòu)的單鏈抗體，當(dāng)其在人類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，可以通過(guò)與預(yù)測(cè)存在的G4結(jié)構(gòu)相互作用，影響一系列基因的表達(dá)。由于BG4與DNA端粒G4結(jié)構(gòu)有很高的親和力[13]， Biffi等[14]于2014年報(bào)道利用BG4抗體發(fā)現(xiàn)在胃癌和肝癌組織中G4表達(dá)增高，因此端粒區(qū)的G4結(jié)構(gòu)也成為本課題研究的切入點(diǎn)。真核細(xì)胞內(nèi)端粒像兩頂帽子蓋在染色體的兩端，由于其特殊的結(jié)構(gòu)，早已成為抗腫瘤研究的重要領(lǐng)域。細(xì)胞端粒酶在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，而在端粒酶的激活過(guò)程中，端粒酶的主要組成單位hTERT起關(guān)鍵作用，其表達(dá)與端粒酶活性密切相關(guān)，控制著端粒酶的活性。端粒是位于染色體末端的由TG構(gòu)成的短串聯(lián)序列，由于該區(qū)域富含G序列可以形成G4結(jié)構(gòu)。本研究中細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證實(shí)G4抗體真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BG4轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞可以阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖，這表明G4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，主要通過(guò)BG4蛋白與細(xì)胞端粒區(qū)的G4結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)一步研究表明是通過(guò)抑制hTERT活性而抑制端粒酶的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，該研究在本課題組前期構(gòu)建G4抗體原核表達(dá)載體pSANG10-BG4的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了G4抗體真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BG4，通過(guò)酶切、測(cè)序?qū)υ撦d體序列進(jìn)行了鑒定，并成功在胃癌細(xì)胞AGS內(nèi)表達(dá)。pEGFP-N1-BG4轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖，抑制端粒酶活性，其機(jī)制與下調(diào)hTERT mRNA與蛋白的表達(dá)有關(guān)，由于腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性調(diào)控方式的多樣性和復(fù)雜性，也可能有更多機(jī)制參與了該過(guò)程。由于研究的細(xì)胞株數(shù)量較少，在不同的腫瘤細(xì)胞株中是否具有相似的作用還需要實(shí)驗(yàn)論證，這些問(wèn)題有待于更進(jìn)一步的研究，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明，以便更好地研究其功能。