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        miR-1246增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制研究*

        2018-11-26 09:03:38徐慶麗李艷華任興業(yè)
        中國(guó)病理生理雜志 2018年11期
        關(guān)鍵詞:電離輻射細(xì)胞系敏感性

        王 倩, 徐慶麗, 李艷華, 任興業(yè)

        (濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科, 山東 濟(jì)南 250022)

        宮頸癌是嚴(yán)重影響婦女健康與生命的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率占所有婦科腫瘤的9%和12%[1]。資料顯示,每年全球有近20萬(wàn)人死于宮頸癌,其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈逐年增加和年輕化趨勢(shì)[2]。根治性子宮切除和局部放射治療是宮頸癌的主要治療方案,但是對(duì)于晚期宮頸癌的治療效果仍不理想[3]。研究表明50%的晚期宮頸癌患者對(duì)放射治療不敏感,導(dǎo)致預(yù)后不良,進(jìn)而誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。因此,放療抗性是晚期宮頸癌治療失敗的主要原因之一,但其分子機(jī)制仍不清楚。微小RNA(micro-RNAs,miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度為18~22個(gè)堿基對(duì)組成的非編碼RNA,參與腫瘤的轉(zhuǎn)移,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為,具有抑癌(miR-15a、miR-29和miR-214)[5-7]或促癌(miR-21、miR-218和miR-193b)[8-9]功能。研究表明,miR-22和miR-181a過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),miR-1246參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過(guò)程[13]及SV40病毒誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[14]。新近研究表明miR-1246在宮頸癌組織中低表達(dá),其低表達(dá)與宮頸癌的臨床分期相關(guān)[15],提示miR-1246是一個(gè)腫瘤相關(guān)因子參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。目前miR-1246在宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的生物學(xué)功能仍不清楚,其能否調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性,尚無(wú)研究報(bào)道。本研究運(yùn)用宮頸癌細(xì)胞系為對(duì)象,體外研究miR-1246過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞對(duì)輻射敏感性,初步探討miR-1246調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制,為以miR-1246為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)宮頸癌輻射增敏劑提供理論依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 材料與試劑

        取來(lái)自濟(jì)南市第五人民醫(yī)院2012-2017年宮頸麟癌組織56例及對(duì)照組48例(包括子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉及慢性輸卵管炎組織樣本)。宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa購(gòu)自ATCC;正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系ESC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和1%青、鏈霉素購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;胰酶和MTT購(gòu)自Sigma;miR-1246模擬物(miR-1246 mimic)和陰性對(duì)照模擬物(negative control mimic,NC-mimic)購(gòu)自廣州銳博生物科技技術(shù)有限公司;microRNA提取試劑盒和Taqman miRNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems;脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen;抗p-ATM、ATM和DYRK1A抗體購(gòu)自Abcam; γH2AX、p-p53和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;Transwell小室和BCA試劑盒購(gòu)自Thermo。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng) HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞均培養(yǎng)在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.2miR-1246表達(dá)水平的檢測(cè) 收集正常培養(yǎng)的HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞,按照mirVana miRNA分離試劑盒提取細(xì)胞、腫瘤和對(duì)照組織miRNA,運(yùn)用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-1246的表達(dá)水平;采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析,miR-1246結(jié)果經(jīng)U6 snRNA校正,相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表1。

        表1 Real-time PCR 引物

        2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,計(jì)數(shù)后種于6孔板中(每孔2.0×104個(gè)),培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將miR-1246 mimic和NC-mimic轉(zhuǎn)染至各細(xì)胞。培養(yǎng)4 h后換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.4電離輻射及細(xì)胞活力檢測(cè) 按照X射線生物輻照儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,輻射劑量率為0.25 Gy/min,運(yùn)用0.5 mm鋁過(guò)濾器對(duì)X射線進(jìn)行過(guò)濾;將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射后,分別于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h檢測(cè)細(xì)胞活力,以未輻照細(xì)胞為對(duì)照組;每孔加入20 μL MTT(5 g/L),37 °C培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,搖床上室溫震蕩5 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度(A)值。

        2.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射后96 h進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),在Transwell每個(gè)培養(yǎng)孔上室中加入1.5×104個(gè)細(xì)胞,下室為無(wú)血清培養(yǎng)基,設(shè)置空白對(duì)照組;37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,經(jīng)4%多聚甲醛固定、乙醇脫水、結(jié)晶紫染色、洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細(xì)胞,在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,通過(guò)每組遷移細(xì)胞數(shù)比較細(xì)胞的遷移能力。

        2.6免疫熒光標(biāo)記與觀察 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射,分別于0 h和2 h進(jìn)行免疫熒光;經(jīng)細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛室溫固定15 min,PBS洗滌后經(jīng)0.1% Triton X-100透化10 min, 2% BSA封閉,孵育 I 抗γH2AX(1 ∶100)和II抗AF594,DAPI核染色,共聚焦顯微鏡拍照。

        2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化,離心收集細(xì)胞,加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl,1% NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉,0.1% SDS)重懸細(xì)胞,超聲破碎、12 000 r/min、4 ℃離心10 min,測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,孵育 I 抗[DYRK1A(1 ∶1 000),γH2AX(1 ∶1 000),p-ATM(1 ∶2 000),ATM(1 ∶1 000),p-p53(1 ∶5 000)],以β-actin為內(nèi)參照,4 ℃孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次、孵育 II 抗(HRP標(biāo)記),室溫孵育1 h?;瘜W(xué)發(fā)光法顯影,蛋白相對(duì)表達(dá)量用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 miR-1246在宮頸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平

        Real-time PCR結(jié)果顯示,miR-1246在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織(P<0.05);同時(shí)宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa中miR-1246的表達(dá)水平顯著低于ESC細(xì)胞(P<0.05);與NC-mimic組相比,轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic的宮頸癌細(xì)胞中miR-1246表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖1。

        Figure 1.The expression level of miR-1246 was detected by TaqMan real-time PCR in the cervical cancer tissues and cells. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs normal tissue; ** P<0.01 vs ESC; ## P<0.01 vs NC-mimic group.

        2 miR-1246過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

        NC-mimic和miR-1246 mimic轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞活性均逐漸降低。與NC-mimic組比較,電離輻射照射后相同條件下,miR-1246過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2。這一結(jié)果說(shuō)明miR-1246過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。

        Figure 2.The effects of miR-1246 over-expression on the radiosensitivity of cervical cancer cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs NC-mimic group.

        3 miR-1246過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

        電離輻射照射后,miR-1246過(guò)表達(dá)明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移,與NC-mimic組細(xì)胞比較,miR-1246過(guò)表達(dá)組HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞遷移率均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。這一結(jié)果說(shuō)明miR-1246過(guò)表達(dá)協(xié)同電離輻射抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移。

        Figure 3.The effects of miR-1246 over-expression on the migration of cervical cancer cells induced by ionizing radiation (×20). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-mimic group.

        圖3miR-1246過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

        4 miR-1246過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

        免疫熒光結(jié)果顯示,4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后2 h,γH2AX (DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物)被明顯激活,提示電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂;相同條件下,miR-1246過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX的熒光強(qiáng)度顯著高于轉(zhuǎn)染NC-mimic的細(xì)胞(P<0.01),提示miR-1246過(guò)表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷,增強(qiáng)細(xì)胞輻射敏感性,見(jiàn)圖4。

        Figure 4.The effect of miR-1246 over-expression on repair of DNA damage in the cervical cancer cells induced by ionizing radiation (×100). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC-mimic group.

        5 miR-1246過(guò)表達(dá)對(duì)DNA損傷反應(yīng)的影響

        Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic后,宮頸癌細(xì)胞系中DYRK1A(miR-1246下游靶基因編碼的蛋白)蛋白水平明顯增高,表明miR-1246在細(xì)胞中高表達(dá)。電離輻射照射后不影響DYRK1A的蛋白表達(dá)水平,而p-ATM、p-p53和γH2AX被明顯激活,總ATM蛋白水平無(wú)明顯變化;相同條件下,miR-1246過(guò)表達(dá)顯著抑制電離輻射誘導(dǎo)p-ATM的激活,ATM激酶下游底物磷酸化p53水平被顯著抑制,說(shuō)明電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷發(fā)生時(shí),miR-1246過(guò)表達(dá)抑制ATM通路;而γH2AX水平顯著高于轉(zhuǎn)染NC-mimic的細(xì)胞,見(jiàn)圖5。這些結(jié)果提示,電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂發(fā)生時(shí),miR-1246通過(guò)抑制ATM通路,阻止損傷信號(hào)的傳遞,導(dǎo)致DNA損傷在細(xì)胞中積累最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        討 論

        資料顯示,晚期宮頸癌患者的5年生存率僅為20%~50%,放射治療對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性宮頸癌的治療效果并不理想,大多數(shù)晚期宮頸癌患者對(duì)放療產(chǎn)生抵抗導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16],是宮頸癌患者死亡的主要原因。因此,尋找和研發(fā)宮頸癌靶向治療藥物迫在眉睫。

        miRNA的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)為開(kāi)發(fā)宮頸癌增敏劑的小分子藥物提供了嶄新的思路。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為腫瘤抑制因子或腫瘤促進(jìn)因子調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及衰老,伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-1246在多種腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-1246過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控p53、NFAT、DYRK1A和NFAT的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18],認(rèn)為miR-1246是一個(gè)腫瘤抑制因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。本研究結(jié)果顯示,miR-1246在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組,體外研究證實(shí)miR-1246在4株宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá),而在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞系ESC中高表達(dá),表明miR-1246的下調(diào)表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究miR-1246在宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的作用,我們運(yùn)用miR-1246模擬物實(shí)現(xiàn)miR-1246在4株宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),結(jié)果顯示,miR-1246過(guò)表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移,電離輻射照射后,miR-1246過(guò)表達(dá)明顯抑制細(xì)胞活性以及增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移,表明miR-1246過(guò)表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)致癌模型的腫瘤組織以及輻射誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中,miR-1246的表達(dá)水平出現(xiàn)異常,提示miR-1246的異常表達(dá)與電離輻射后細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

        目前,宮頸癌放療耐受的分子機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn),外界應(yīng)激如紫外線、電離輻射和活性氧自由基等刺激細(xì)胞引起DNA損傷時(shí),p53通路被激活,通過(guò)激活下游靶基因p21的轉(zhuǎn)錄活性,使細(xì)胞周期阻滯,促進(jìn)DNA損傷修復(fù),無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑被清除[19]。γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物,電離輻射殺死腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA斷裂,引起無(wú)法修復(fù)的DNA損傷最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。本研究結(jié)果顯示,miR-1246過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞,提示miR-1246過(guò)表達(dá)DNA損傷加劇或DNA損傷修復(fù)功能被抑制,提示miR-1246過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中發(fā)生DNA損傷的積累。目前關(guān)于miR-1246在DNA損傷修復(fù)中的研究尚未報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246過(guò)表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)γH2AX的激活,表明miR-1246具有抑制DNA損傷修復(fù)的功能。本研究進(jìn)一步研究miR-1246抑制DNA損傷修復(fù)分子機(jī)制。有研究表明DNA損傷發(fā)生時(shí),PI3K家族激酶如ATM和ATR和DNA-PK通路的激活在DNA損傷修復(fù)中起著關(guān)鍵作用,ATM、ATR激酶作為DNA損傷感受器,DNA DSB主要激活A(yù)TM通路,使下游底物如p53、CHK1、CHK2和MDC1等磷酸化,通過(guò)級(jí)聯(lián)放大方式傳遞損傷信號(hào),招募損傷修復(fù)因子或蛋白至DSB位點(diǎn)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[21]。本研究結(jié)果顯示miR-1246過(guò)表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)γH2AX的激活,抑制p-p53水平,提示miR-1246過(guò)表達(dá)抑制ATM通路,損傷加劇。本研究結(jié)果表明,miR-1246過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制電離輻射誘導(dǎo)ATM通路的激活,阻斷DNA損傷信號(hào)的傳遞,損傷積累誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,最終增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。本研究為以miR-1246為靶點(diǎn)研發(fā)宮頸癌小分子放療增敏劑提供了理論依據(jù)。

        Figure 5.The effects of miR-1246 over-expression on DNA damage responses in cervical cancer cells. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs NC-mimic group; * P<0.05, ** P<0.01 vs NC-mimic+10 Gy group.

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