高建明， Erle S. ROBERTSON

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系， 美國 賓夕法尼亞州 費(fèi)城 19104)

卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又稱γ-皰疹病毒8型，被發(fā)現(xiàn)于1994年，與卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primary effusion lymphoa，PEL)和多中心卡斯特曼病(multicentric Castleman disease)有關(guān)[1]。

復(fù)制及轉(zhuǎn)錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)是卡波西肉瘤病毒開放閱讀框50編碼的一種即刻早期蛋白，是促使病毒從潛伏性感染向裂解性復(fù)制轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子[2]。我們已經(jīng)報(bào)道KSHV RTA能夠增強(qiáng)存活蛋白(survivin)基因啟動子活性，上調(diào)宿主細(xì)胞的survivin表達(dá)[3]， survivin基因啟動子區(qū)域的GC/Sp1和p53順式元件對RTA上調(diào)宿主細(xì)胞survivin表達(dá)具在重要作用[4]。本文進(jìn)一步探討KSHV RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)對宿主細(xì)胞增殖、凋亡、病毒子代產(chǎn)生及裂解基因表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 抗體與細(xì)胞

抗survivin小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz；抗GAPDH抗體購自Novus Biologicals；偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG購自Rockland。BJAB為KSHV和EB病毒均陰性的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系；JSC是感染KSHV的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建 Survivin小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)用shSur表示；對照shRNA(control shRNA)以shC表示；pGIPZ 是一種shRNA慢病毒載體，用來表達(dá)survivin shRNA，均購自O(shè)pen Biosystems。RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)方法已在相關(guān)文獻(xiàn)中詳細(xì)報(bào)告[5]，本研究中，我們構(gòu)建了JSC-shSur細(xì)胞、BJAB-shSur細(xì)胞及其對照J(rèn)SC-shC細(xì)胞和BJAB-shC細(xì)胞。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn) JSC-shSur細(xì)胞、BJAB-shSur細(xì)胞及其對照細(xì)胞用20 μg/L 12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate， TPA)和1.5 mmol/L butyrate誘導(dǎo)，培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，加入RIPA 緩沖液裂解，用Bradford 比色法測定蛋白濃度。取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液上樣，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF膜，分別用抗survivin抗體、抗GAPDH抗體及偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG II抗進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。用Odyssey紅外線成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences)觀察結(jié)果。

2.3病毒子代DNA的PCR擴(kuò)增 JSC-shSur細(xì)胞及其對照J(rèn)SC-shC細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h，離心棄細(xì)胞，用0.45 μm 孔徑的過濾器收集上清， 23 500 r/min離心20 min沉淀病毒顆粒。加50 μL 0.2× PBS重懸病毒顆粒，95 ℃ 15 min，加入1 μL 蛋白酶K(10 g/L)于56 ℃孵育1 h，95 ℃ 30 min滅活蛋白酶K。取5 μL 病毒裂解液作模板，PCR擴(kuò)增KSHV編碼的K9，K9引物見表1。以JSC細(xì)胞中分離的KSHV基因組DNA為對照。PCR產(chǎn)物條帶的灰度采用Kodak 1D 3.6軟件定量。

2.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn) JSC-shSur細(xì)胞和JSC-shC細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后培養(yǎng)24、48和72 h，用TRIzol(Invitrogen)法細(xì)胞總RNA抽提，以高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，病毒裂解基因ORF57、TK 及內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表1。10 μL體系含5 μL Master Mix、 1 μL 5 μmol/L的引物和4 μL稀釋的cDNA。反應(yīng)條件： 95 ℃變性5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72℃ 30 s，30個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采集與分析使用StepOnePlus 實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞(1×109/L)，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4 ℃過夜。離心棄去固定液，PBS重懸細(xì)胞。加入終濃度50 mg/L PI(Sigma)和1 mg/L RNA酶于4 ℃避光染色1 h。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)檢測細(xì)胞凋亡，采用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。每個樣本重復(fù)測定6次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RTA介導(dǎo)的宿主細(xì)胞survivin表達(dá)上調(diào)促進(jìn)病毒子代產(chǎn)生

Survivin是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要分子，RTA能夠上調(diào)survivin表達(dá)，因此我們推測RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)具有抑制宿主細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)病毒子代產(chǎn)生的生物學(xué)功能。為此，我們應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了survivin抑制的穩(wěn)定細(xì)胞株JSC-shSur和BJAB-shSur及其對照細(xì)胞JSC-shC和BJAB-shC。Western blot分析證實(shí)JSC-shSur細(xì)胞和BJAB-shSur細(xì)胞的survivin表達(dá)水平均比對照組明顯降低,見圖1A。JSC-shSur細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h，制備細(xì)胞的病毒懸液，PCR擴(kuò)增KSHV 編碼的K9基因，以K9拷貝數(shù)代表病毒子代產(chǎn)生水平，結(jié)果顯示JSC-shSur細(xì)胞的病毒子代產(chǎn)量分別為其2種對照細(xì)胞JSC-shC和JSC細(xì)胞的1/3和1/9(P<0.05)，見圖1B。這表明RTA能夠利用survivin信號通路促進(jìn)宿主細(xì)胞病毒子的產(chǎn)生。

Figure 1.RTA-mediated survivin up-regulation promoted the production of virus progeny. A: Western blot showed survivin expression in survivin knockdown cells and control cells; B: virus lysates of TRA and butyrate-induced JSC-shC cells and JSC-shSur cells were prepared after induction for 48 h to analyze the production of KSHV progeny by PCR. KSHV genomic DNA isolated from the JSC cells served as control. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC control or JSC-shC-IN group.

2 RTA介導(dǎo)的宿主細(xì)胞survivin表達(dá)上調(diào)促進(jìn)病毒裂解基因表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明，JSC-shSur細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后24～72 h，病毒裂解基因ORF57和TK的表達(dá)水平逐漸升高，但JSC-shSur細(xì)胞2種裂解基因的表達(dá)水平在誘導(dǎo)后48 h和72 h均顯著低于survivin表達(dá)正常的對照組JSC-shC細(xì)胞(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.RTA-mediated survivin up-regulation promoted the expression of KSHV lytic genes. Real-time PCR was used to analyze the ORF57 and TK transcripts in induced and uninduced JSC-shC and JSC-shSur cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC-shC group.

3 RTA介導(dǎo)的宿主細(xì)胞survivin表達(dá)上調(diào)延緩宿主細(xì)胞凋亡

KSHV陰性細(xì)胞BJAB-shC與BJAB-shSur經(jīng)TPA誘導(dǎo)24 h，細(xì)胞凋亡率分別為7.0%和10.9%；TPA誘導(dǎo)48 h，細(xì)胞凋亡率分別為55.0%和57.7%，在相同時點(diǎn)，2種細(xì)胞誘導(dǎo)后的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。KSHV陽性細(xì)胞JSC-shC與JSC-shSur經(jīng)TPA誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞凋亡率分別為32.0%和39.6%；TPA誘導(dǎo)48 h的細(xì)胞凋亡率分別為74.0%和85.2%。在相同時點(diǎn)，2種細(xì)胞誘導(dǎo)后的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Survivin knockdown enhanced the apoptosis of TPA and butyrate-induced KSHV-infected cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC-shC-IN group.

討 論

KSHV存在2種不同的生活周期，即潛伏性感染與裂解性復(fù)制[6-7]。病毒在潛伏性感染時以游離體的形式存在，只表達(dá)少數(shù)潛伏基因；在裂解性復(fù)制期，感染性病毒子代釋放，一系列病毒編碼基因以級聯(lián)反應(yīng)的方式激活，調(diào)控多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)號通路[2, 8-9]。KSHV陽性細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后1 h就可檢出RTA的表達(dá)[10]。無論是外源性還是內(nèi)源性來源引起的RTA表達(dá)增高，均可介導(dǎo)病毒裂解性基因的級聯(lián)表達(dá)[11]。

Survivin是哺乳動物凋亡抑制蛋白家族的一個成員，具有抑制細(xì)胞凋亡及參與細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的雙重功能[12]。感染細(xì)胞的凋亡是機(jī)體抗病毒的一種防御機(jī)制；反之，病毒亦可通過多種途徑干擾機(jī)體介導(dǎo)的感染細(xì)胞的凋亡。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)KSHV RTA能夠與survivin基因啟動子結(jié)構(gòu)中的GC/Sp1和p53 順式元件相互作用，上調(diào)宿主細(xì)胞survivin表達(dá)[3-4]。

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制survivin表達(dá)后， KSHV陽性的JSC細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后與對照組細(xì)胞相比病毒子產(chǎn)生減少，裂解基因表達(dá)下調(diào)，凋亡率增加。由此可見RTA介導(dǎo)的survivin表達(dá)上調(diào)可以延緩宿主細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)病毒的裂解性復(fù)制，有利于病毒的生存與傳播。