張宗彥,張 雯,劉妙齡,賁亞琍

（江漢大學(xué)：1醫(yī)學(xué)院免疫疾病研究所；2學(xué)生工作部，湖北武漢 430000）

T載體為線狀的DNA片段，3’端帶有突出的“T”尾，同時(shí)Tap酶在PCR產(chǎn)物的5’末端加上非模板依賴性A堿基。TA克隆技術(shù)利用T堿基與A堿基互補(bǔ)配對(duì)，快速準(zhǔn)確的使PCR產(chǎn)物在連接酶的作用下與T載體粘性連接，重組為環(huán)狀DNA分子，從而極大提高克隆效率。人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Human endogenous retrovirus sequences,HERVs）普遍存在于人類染色體中，是與逆轉(zhuǎn)錄病毒同源的DNA序列[1]，約占人類基因組的8%[2]。近年來很多研究表明，HERVs基因的活化與多種疾病相關(guān)[3-4]，包括與白血病[5]、乳腺癌[6]、1型糖尿病[7-8]等。本實(shí)驗(yàn)通過分離人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），選擇HERV-K基因p1442-1888片段，構(gòu)建pGEM-T載體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與主要試劑

健康者血液由志愿者提供。主要試劑包括：淋巴細(xì)胞分離液（灝洋華科），總RNA提取試劑盒（天根公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)，凝膠回收試劑盒（QIAGEN公司），PCR Mix（Thermo公司），pGEM?-T克隆試劑盒(Promega公司)，EcoRI(Thermo公司)，質(zhì)粒小提試劑盒（AXYGEN公司），異丙醇，感受態(tài)細(xì)菌（DH5α），LB培養(yǎng)基等。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

引物依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究所基因及染色體基因組數(shù)據(jù)庫提供HERV-K序列設(shè)計(jì)并合成。引物序列上游：5'-ATGAAAACGCCAATCCTGAG-3'；下游：5'-CAAATGGCTGAATTGGGAAT-3'。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為446 bp。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離PBMC

用含肝素采集管采集全血5 mL，200 r/min離心10 min，分離最上層血清。用等體積的PBS替代吸取的血清，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，從底部緩慢加入15 mL淋巴細(xì)胞分離液。800 r/min離心20 min后將中間層白色絮狀物吸入一個(gè)新的50 mL離心管，加入PBS至50 mL刻度線。250 r/min離心10 min，棄上清。重新用30 mL PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，250 r/min離心10 min。

1.3.2 提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄

按總RNA提取試劑盒要求進(jìn)行總RNA提取。隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在12 μL反應(yīng)體系中加入Random Hexamer primer 1μL，總 RNA 0.1 ～ 5 μg，Nuclease-free純水至12 μL，輕柔混勻，65 ℃水浴5 min。冰上靜置后，加入 5 × Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase Inhibitor 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，ReverAid M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，共 20 μL反應(yīng)體系。置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃60 min；70℃酶失活5 min，最后逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

在20 μL反應(yīng)體積中加入2×PCR Master Mix Green 18 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 1 μL。 上述反應(yīng)體系混勻后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，12個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 45 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.4 凝膠DNA提取

PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切取DNA片段，放于1.5 mL離心管中稱量后，加入3倍體積Buffer QG。50℃水浴10 min，檢查其顏色為黃色后加入1倍體積異丙醇混勻并移入2 mL吸附柱內(nèi)。17 900 r/min離心1 min，棄收集液。加500 μL Buffer QG于吸附柱內(nèi)，17 900 r/min離心1 min，棄收集液。加750 μL Buffer PE于吸附柱內(nèi)，17 900 r/min離心1 min，棄收集液。將吸附柱放入新的1.5 ml收集管內(nèi)，加50 μL Buffer EB，放置1 min，17 900 r/min離心1 min，棄吸附柱。收集的液體即為提取的DNA溶液。提取DNA溶液通過光密度分析儀測定其濃度及OD值。

1.3.5 TA克隆

在10 μL反應(yīng)體系中加入2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，pGEM-T Easy Vector 1 μL，PCR 產(chǎn)物 3 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，混勻后室溫放置1 h，4 ℃過夜，構(gòu)建HERV-K基因p1442-1888片段pGEM-T載體。構(gòu)建完成的T載體2 μL與感受態(tài)細(xì)菌DH5α混勻，冰上放置30 min，42℃水浴90 s，冰浴2 min。加250 μL LB液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)60 min(200 r/min)。將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂在培養(yǎng)皿（含有100 μg/mL的Ampicillin）中，倒置平皿，37 ℃培養(yǎng)過夜(12～16 h)，出現(xiàn)菌落。藍(lán)白斑篩選,挑取白色陽性單個(gè)菌落，加入到3 mL LB（含Ampicillin）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。菌液質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3.6 重組質(zhì)粒酶切和PCR鑒定

在10 μL反應(yīng)體系中加入EcoRI 1 μL，10 × buffer EcoRI 1 μL，提取質(zhì)粒 8 μL。將上述反應(yīng)體系混勻后放于37℃水浴進(jìn)行酶切4 h，瓊脂糖凝膠電泳。陽性質(zhì)粒酶切后生成500 bp左右條帶。PCR擴(kuò)增用于鑒定是否為陽性質(zhì)粒（方法同前）。

2 結(jié)果

2.1 PBMC細(xì)胞計(jì)數(shù)

健康者5 mL血樣可獲得的白細(xì)胞總數(shù)為8×106。

2.2 PCR凝膠電泳結(jié)果

依據(jù)引物設(shè)計(jì)，PCR目標(biāo)產(chǎn)物是分析HERV-K gag基因，序列長度446 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在250～500 bp之間可見一條特異擴(kuò)增帶，片段大小符合預(yù)期值（圖1）。250 bp下方條帶為引物二聚體，不影響后期實(shí)驗(yàn)。

圖1 PBMC cDNA PCR凝膠電泳

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

HERV-K gag基因成功插入載體，并轉(zhuǎn)染成功的菌落為白色；沒有基因插入但生成藍(lán)色菌落的克隆為假陽性（圖2A）。挑取單個(gè)白色菌落擴(kuò)增后，質(zhì)粒小提，并通過酶切和PCR驗(yàn)證。圖2B顯示，經(jīng)EcoRI酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒酶切片段大小在400～500 bp之間，與預(yù)期基因片段大小一致。圖2C顯示，以重組質(zhì)粒為模版，經(jīng)PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在400 bp處，符合預(yù)期擴(kuò)增片段（446 bp）。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定

3 討 論

HERV為古老的逆轉(zhuǎn)錄病毒殘余物，這類病毒是在數(shù)百萬年前整合到人類基因組中，并以孟德爾方式遺傳至今[3,9-10]。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒原始的分子特性，HERV可以通過逆轉(zhuǎn)錄和重組進(jìn)行基因內(nèi)的傳播，因而創(chuàng)造出多種HERV基因[11-12]。長期的進(jìn)化使HERV序列發(fā)生了大量的突變，導(dǎo)致其毒力喪失[13-15]。但研究表明，人類疾病與HERV相關(guān)，尤其是一些多因素疾病及與免疫功能失調(diào)相關(guān)的疾病，例如多發(fā)性硬化，1型糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HERV家族有31個(gè)，HERV-K家族因有完整的gag、env、pol等病毒基因的開放閱讀框架（open reading frames，ORFs）和相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄活性，而具有潛在的生物學(xué)功能和致病性[16]。其中g(shù)ag基因編碼病毒的核心蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，直接裝配和促進(jìn)病毒粒子萌芽的功能［5,17］。在NOD小鼠中的研究表明，胰島來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)HERV-K gag基因，提示HERV基因的異?；罨赡苁且l(fā)Ⅰ型糖尿病自身免疫反應(yīng)的原因[18]。本實(shí)驗(yàn)以健康人外周血白細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用TA克隆技術(shù)成功構(gòu)建pGEM-HERV-K gag質(zhì)粒，通過質(zhì)粒測序進(jìn)行g(shù)ag基因的鑒定和比對(duì)，以此鑒別特異的HERV-K家族成員。

4 結(jié) 論

重組質(zhì)粒pGEM-HERV-K gag的構(gòu)建，可用于比較患者和健康人群是否攜帶或表達(dá)不同的HERV-K成員，為研究人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV-K）gag基因序列與1型糖尿病病的關(guān)系，尋找疾病診斷和治療的新靶向奠定基礎(chǔ)。