陶涌 張玉霞 劉宇

孔雀石綠（malachite green，MG），又名堿性綠，是一種帶有金屬光澤的三苯甲烷類工業(yè)染料，常用來預防和治療魚類外部真菌和寄生蟲感染，曾廣泛應用于水產養(yǎng)殖業(yè)中。由于孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用，美國早在1993年已將孔雀石綠列為優(yōu)先研究的致癌性化學物質，我國在農業(yè)行業(yè)標準《NY5071- 2002無公害食品魚藥使用準則》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。然而，由于沒有低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。目前國內外對孔雀石綠的檢測多采用高效液相色譜、高效液相色譜-質譜聯用等方法，這些方法檢測過程繁瑣，對檢測儀器和檢測人員要求較高，且需要對樣品進行排除干擾和分離富集等復雜的前處理工作，不利于現場應用?？兹甘G殘留對自然系統(tǒng)和人類健康的潛在危險越來越受到人們的重視，對其進行有效跟蹤、監(jiān)測非常必要。因此，建立簡便、快速的分析方法對孔雀石綠殘留具有重要的意義。

本文結合分子印跡技術（Molecularly imprinted polymer，MIP）和固相微萃取技術（Solid- phase Microextraction，SPME）的優(yōu)點，在MIP- SPME中引入電場作為新的作用力，發(fā)展了電吸附-分子印跡固相微萃?。‥E- MIP- SPME）樣品前處理聯用技術。設計聯用萃取技術裝置，以自制的孔雀石綠（malachite green，MG）MIP- SPME涂層研究EE- MIP- SPME技術的萃取條件和萃取性能，建立MIPMG- SPME/HPLC聯用分析方法，實現復雜生物、環(huán)境樣品中孔雀石綠殘留的痕量分析。

孔雀石綠（MG，分析純），隱性孔雀石綠（LMG，分析純）購于國藥基團化學試劑有限公司。色譜純乙腈和甲醇購自美國Sigam公司。商品化的固相微萃取纖維（100 μm，PDMS涂層）購自美國Supelco公司。

MIPPy- MWCNTs/Pt纖維制備及EE- MIPSPME實驗在恒電位儀上完成。首先將拋光打磨后的Pt絲和不銹鋼絲，插入多壁羧基碳納米管（MWCNTs- COOH）的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）分散液中，Pt絲為正極，不銹鋼絲為負極，施加35 V電壓，Pt絲在溶液中停留大約5S后拔出。重復上述操作，以增加碳納米管在Pt絲上的聚合厚度，最終將Pt絲放入紅外干燥箱，干燥得到MWCNTs/Pt纖維。將制備好的纖維作為正極，不銹鋼絲作為負極，飽和甘汞電極做參比電極，在吡咯-孔雀石綠（PPyMG，0.05 mol/L）混合溶液中進行電聚合反應。在0.95 V的電壓下，聚合反應40min。在碳納米管表面形成以孔雀石綠為模板分子的分子印跡聚吡咯纖維（MIPPy- MWCNTs/Pt）。

將MIPPy- MWCNTs/Pt纖維為工作電極、不銹鋼絲為對電極、飽和甘汞電極為參比電極。于20mL小瓶中加入15mL不同濃度的MG溶液，在工作電極施加一定電壓，攪拌下萃取。萃取完成后，纖維用400 μL的2%乙酸的甲醇-水溶液（v/v=8：2）解吸，取20 μL解吸液進行液相色譜分析。

色譜條件：在室溫條件下進行，Zorbax XDB- C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm×5μm），流動相為醋酸/醋酸銨（50 mmol /L，pH為4.5）：乙腈=40：60 （V/V），流速1.0 mL/min，紫外檢測波長608 nm，進樣量為20 μL。

以自制孔雀石綠MIPPy- MWCNTs/Pt纖維研究了EE- MIP- SPME方法的萃取條件，如聚合物配方、施加電壓、萃取時間、解吸溶劑和時間、萃取溶劑、鹽濃度等。在電場作用下，吸附劑與吸附質之間的各種作用力得到增強，使得吸附劑的吸附能力增強。通過在SPME纖維上施加電壓改善固定相的吸附特性，實現對目標物質的增強吸附。因此，施加電壓的大小是影響萃取過程的關鍵因素。實驗分別比較了在EE- MIP- SPME、MIP- SPME和SPME不同模式下對不同濃度MG的水溶液的萃取效率。結果如圖1所示：EE- MIP- SPME、MIP- SPME的萃取量隨著樣品濃度的增加而增加，EE- MIP- SPME對MG具有更高的萃取能力，特別是在低濃度范圍內具有更明顯的促進作用。采用萃取時間為60 min，樣品溶液1μmol/L，考察了施加電壓對孔雀石綠MIP涂層萃取性能的影響。電壓在0～0.8V時，隨著電壓的增加，孔雀石綠的萃取量逐漸增大；當電壓超過0.8V以后，MG萃取量迅速降低，結果如圖2所示。

為了驗證所制備的孔雀石綠M IPPyMWCNTs/Pt萃取纖維的選擇性吸附效果，實驗選取孔雀石綠的結構類似物結晶紫（CV）和非結構類似物蘇丹紅II（Sudan II）兩種對照物，同時用MIPPy- MWCNTs/Pt與NIPPy- MWCNTs/ Pt（非分子印跡吡咯聚合物）作為固相微萃取纖維，在最優(yōu)萃取條件下，進行EE- MIP- SPME萃取實驗。如圖3所示，與 NIP 萃取纖維相比，MIP萃取纖維對MG及其結構類似物CV具有更高的萃取效率，這表明MIP萃取纖維對模板分子及其結構類似物具有很好的選擇，而對非目標分子的識別較低。目標物質在 MIP 和NIP 萃取纖維上吸附能力的不同，可能是由于他們在孔徑、形狀及與分析物間功能基團之間的不同造成。

本實驗方法在最優(yōu)萃取條件下，通過EEMIP- SPME聯用液相色譜（HPLC），對MG，CV混合水溶液的檢出限和線性范圍進行了考察。實驗結果顯示：在不同濃度水平上隨著目標物濃度增加，EE- MIPPy- SPME對兩種物質的吸附效率，在1- 500 μg/L范圍內，均呈現較好的線性關系，相關系數r分別0.9996和0.9958，檢出限為：MG 1.55 μg/L，CV 1.47 μg/L。

為了證實所建立的實驗方法具有潛在應用價值，我們將該方法用于加標魚池水和魚肉樣品中孔雀石綠殘留的分析，圖4顯示的分別是自制MIP萃取纖維在SPME和EE- MIP- SPME模式下對加標魚池水樣萃取后得到色譜圖?？梢钥闯觯翰捎肕IP纖維SPME萃取，目標物峰高要比NIP纖維的高（圖4c，4d）。圖4e是在MIP纖維上施加直流電壓后萃取得到的色譜圖，得到的峰面積進一步增大。兩種實際樣品的加標回收率分別為87.7%- 108.7%和85.7%- 103.2%，相對標準偏差（RSD）為1.2% - 9.6%和4.6% -8.3%。實際樣品中目標分子的高回收率和低干擾性，表明本實驗建立的EE- MIP- SPME方法具有較高的選擇性，以孔雀石綠為模板，自制的MIPPy- MWCNTs/Pt萃取纖維具有良好的吸附性能。歐盟法律規(guī)定動物源食品中孔雀石綠的殘留量不得超過 2 μg/kg，因此本研究建立的方法能夠適用于監(jiān)測復雜食品樣基質中痕量孔雀石綠殘留的含量。

1： MG；2： CV；a：魚池水樣品直接進樣；b：經商品化SPME萃??；c：經NIP纖維SPME萃?。籨：經MIP纖維-SPME萃取；e：經EE-MIP-SPME萃取的加標樣品

項目基金：湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項目（湘食藥科R201720）。