張敏新 ，王書(shū)林 ，余宇燕

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建 福州 350025）

益氣補(bǔ)血湯是我院中醫(yī)科專(zhuān)家長(zhǎng)期在臨床使用的驗(yàn)方，本處方主要由黃芪、當(dāng)歸等8味中藥組成，具有益氣生血、補(bǔ)腎填精，促進(jìn)因放化療引起的骨髓功能損傷的修復(fù)及調(diào)整機(jī)體免疫的功效。適用于放、化療后白細(xì)胞減少，貧血及免疫功能低下者［1］。臨床驗(yàn)證表明該方療效顯著，安全性好。為了提高患者的順應(yīng)性，將其制成口服液，使其更便于服用、保存、運(yùn)輸。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS／MS），通過(guò)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）對(duì)處方中的君藥黃芪、當(dāng)歸及臣藥白芍、淫羊藿中的淫羊藿苷、芍藥苷、阿魏酸和黃芪甲苷等4個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。本方法具有檢測(cè)時(shí)間短、分離度好的特點(diǎn)，亦可以避免性質(zhì)相近的化學(xué)成分相互干擾，且 LC-MS／MS檢測(cè)靈敏度高，不受化合物生色基團(tuán)的限制，更適于中藥樣品中多組分的同時(shí)測(cè)定［2-3］。本方法的建立可為益氣補(bǔ)血口服液的質(zhì)量控制提供參考，提高高效液相色譜方法的檢測(cè)效率，縮短分析時(shí)間。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)試藥 黃芪甲苷（110781-201314，含量測(cè)定用）、淫羊藿苷（110737-200415，含量測(cè)定用）、芍藥苷（110736-201337，含量測(cè)定用）、阿魏酸（110773-201313，含量測(cè)定用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；益氣補(bǔ)血口服液及其陰性口服液均為自制；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó) Fisher公司）、95%乙醇（醫(yī)用酒精，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，迪馬科技）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 島津30A液相色譜儀［LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司］；AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；KQ-800KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DC215CD十萬(wàn)分之一電子天平、SE6001F電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］，RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別取芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，以70%甲醇水溶解并分別制成含芍藥苷102.4μg／mL、阿魏酸 108.0 μg／mL、淫羊藿苷 282.9 μg／mL 和黃芪甲苷105.9μg／mL儲(chǔ)備液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密吸取樣品溶液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加70%甲醇水約10 mL，超聲處理5 min，放至室溫，以70%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按益氣補(bǔ)血口服液制備工藝，分別制備缺白芍、黃芪、淫羊藿及同時(shí)缺當(dāng)歸和黨參的陰性溶液。按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備各陰性對(duì)照溶液，即得。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件色譜條件 色譜條件：采用phenomenex Kinetex C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），柱溫 40 ℃，以乙腈-0.2%甲酸、1 mmol／L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～1 min，30%乙腈；1～10 min，30%乙腈→70%乙腈），流速 0.4 mL／min，進(jìn)樣量5μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），氣簾氣壓力 20.0 psi，加熱氣溫度為 550℃，輔助氣壓力60.0 psi，霧化氣壓力55.0 psi，電壓為5 500 V（正離子模式）、-4 500 V（負(fù)離子模式）。芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷以負(fù)離子掃描方式，黃芪甲苷以正離子掃描方式MRM模式，4個(gè)主要成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)下表 1，供試品及陰性樣品的總離子流圖譜見(jiàn)圖 1。

表1 4個(gè)分析物的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 混合對(duì)照品（A）、供試品（B）、缺白芍陰性樣品（C）、缺當(dāng)歸陰性樣品（D）、缺淫羊藿陰性樣品（E）、缺黃芪陰性樣品（F）總離子流圖

2.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加70%甲醇水稀釋制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明 4個(gè)成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見(jiàn)表 2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 制備中間濃度混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為1.89%、0.86%、1.45%和4.84%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備同一批樣品（批號(hào)180110）的供試品溶液 6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷的平均含量分別為 1.93、0.25、0.66、0.13 mg／mL，RSD 分別為4.7%、4.0%、2.2%、4.4%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.31%、1.14%、1.53%、4.10%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一已知含量的益氣補(bǔ)血口服液（批號(hào)180110）9份，每份5.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，精密加入各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，使高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在 1.5∶1、1∶1 和 0.5∶1［4］，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)（n＝9）

2.8 樣品測(cè)定 取3批次益氣補(bǔ)血口服液樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定其含量，見(jiàn)表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果mg／mL

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇 芍藥苷［5］、阿魏酸［5］由于極性較大，中藥復(fù)方制劑中極性成分往往相對(duì)較多，各成分之間的干擾大，完全分離相對(duì)較難。筆者曾以乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相，色譜柱填充劑 Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1.0 mL／min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷在相對(duì)保留時(shí)間為15.1 min時(shí)，仍未能有效分離，再加上阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷等成分，單個(gè)樣品的分析時(shí)間需要約100 min左右，分析時(shí)間較長(zhǎng)且分離效果不理想、前處理過(guò)程較復(fù)雜［5］。采用液-質(zhì)聯(lián)用，以MRM 方式測(cè)定，有效避免其他成分的干擾，專(zhuān)屬性更高［6］，可以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷的含量。

3.2 芍藥苷質(zhì)譜條件的考察 芍藥苷在ESI＋模式下， 可產(chǎn)生 m／z 481.2→463.1，319.2，301.1，197.1，178.9等碎片離子，其中以m／z 301.1的碎片離子豐度較高，前期選擇了m／z 481.2→301.1作為離子對(duì)進(jìn)行MRM分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其色譜峰前面出現(xiàn)較大的干擾峰，且分離較為困難，故又以ESI－模式進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生 m／z 479.1→449.0，357.2，327.0，121.0等碎片離子，其中以m／z 449.0的碎片離子豐度較高，但由于芍藥苷在樣品中含量相對(duì)較高，如果樣品稀釋倍數(shù)過(guò)大，其他成分的含量就相對(duì)偏低，故最終選擇相對(duì)豐度較低的離子對(duì)m／z 479.1→357.2為其定量離子對(duì)。

3.3 阿魏酸質(zhì)譜條件的考察 阿魏酸在ESI＋模式下，可產(chǎn)生 m／z 195.1→176.9等碎片離子，但同樣由于其含量相對(duì)較高，稀釋倍數(shù)小時(shí)，其色譜峰為平頭峰，故最終選擇在ESI－模式下檢測(cè)，以m／z 194.0→150.1為其定量離子對(duì)。

3.4 流動(dòng)相的選擇 由于芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷等在酸性流動(dòng)相中，峰形較好，故選擇在水相中加入少量的甲酸。但黃芪甲苷在水及甲酸溶液中易產(chǎn)生加Na峰（m／z 807.4），故在流動(dòng)相中加入適量的乙酸銨以抑制其加Na峰的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)建立LC-MS／MS法同時(shí)測(cè)定益氣補(bǔ)血口服液中芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黃芪甲苷4個(gè)成分的含量，該方法簡(jiǎn)便、快捷，靈敏度高，專(zhuān)屬性好，可用于益氣補(bǔ)血口服液的質(zhì)量控制。LC-MS／MS法已逐漸成為中藥及中藥復(fù)方制劑多成分同時(shí)測(cè)定的較佳方法［7］。