王廣宇，王 雨，王雷永，徐旭英

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科（簡稱我科）對糖尿病伴足部慢性潰瘍（diabetic foot chronic ulears，DFCUs）的長期治療過程中，基于傳承，總結(jié)認(rèn)為：創(chuàng)面局部存在虛、瘀、毒三個病理過程，并且相互轉(zhuǎn)化、影響，某一階段為主要矛盾，提出祛腐、化瘀、補虛為主要治則，以朱紅膏、紫色疽瘡膏、回陽生肌膏為核心藥物的“生肌三法”理論。α－平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，αSMA）、CD68、CD34 分別是成纖維細(xì)胞內(nèi)、巨噬細(xì)胞表面、內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，細(xì)胞DNA合成期表達，反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)和局部創(chuàng)面增生、去除壞死組織、循環(huán)狀態(tài)的能力。本文依據(jù)生肌三法辨證選取創(chuàng)面組織，利用免疫熒光四重染色技術(shù)，對其皮膚真皮淺層的病理學(xué)特點做初步探討。

1 臨床資料

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2015年國際糖尿病足工作組發(fā)布《國際糖尿病足慢性創(chuàng)面管理指南》［1］中DFCUs的診斷標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病伴足部潰瘍4周以上未能愈合，也無明顯愈合趨勢的創(chuàng)面。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［2］局部辨證方法：① 濕熱證：創(chuàng)面滲出較多，腐肉不脫，創(chuàng)周紅腫，界限不清；② 血瘀證：創(chuàng)面潰爛經(jīng)久，滲出物較少或干枯無膿，腐肉少許或腐肉雖脫，但新肉難生，創(chuàng)周膚色暗無紅腫；③陽虛證：創(chuàng)面灰白色或紫暗，腐肉較多伴有滲出物清稀，或如粉漿，創(chuàng)周無紅腫。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 符合上述診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn)者；② 年齡65～85歲；③ 瘡面面積4～30 cm2，深至皮下組織，但未及骨質(zhì)；④ 同意加入本研究，并簽屬知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 合并有放射、結(jié)核、癌性等創(chuàng)面；② 合并有惡性腫瘤、急性心腦血管意外、腎功能不全、嚴(yán)重肝臟損傷等全身性疾病。

1.5 一般資料 選取2016年1月—2017年5月于我科住院的DFCUs患者30例，符合入選條件患者依據(jù)局部辨證方法分為濕熱證組、血瘀證組、陽虛證組各10例，3組年齡、病程、潰瘍面積等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。另外取5例大腿截肢患者截除肢體近端皮膚組織標(biāo)本作為正常組。本臨床研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 主要試劑和儀器 M ASSON復(fù)合染色液、DAB顯色液（北京中杉金橋公司）；TSA plus熒光試劑盒（美國PerkinElmer公司），其中包括TNT洗滌緩沖液（貨號：PF1011）、TNB 封閉緩沖液（貨號：PF1012）；ZEN顯微圖像分析軟件（德國Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）

2.2 標(biāo)本采集及處理 本研究所需標(biāo)本均為清創(chuàng)或截肢后廢棄的組織，所取標(biāo)本需包括創(chuàng)面邊緣皮膚及皮膚真皮淺層，截除肢體選擇近端皮膚組織。組織獲取后立即放入10%中性福爾馬林溶液中保存，按常規(guī)方法進行脫水、固定、石蠟包埋。

2.3 MASSON三染 石蠟標(biāo)本切片 4～5μm，脫蠟至水，置于玻片上，嚴(yán)格按說明書步驟進行染色。

2.4 免疫熒光四重染色 ① 標(biāo)本準(zhǔn)備：將石蠟標(biāo)本切片4～5μm，脫蠟至水，置于玻片上。② 消除內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，傾倒后組織切片上滴注TNB封閉緩沖液，濕室中37℃孵育45 min。③ 滴加一抗：傾走TNB封閉緩沖液，滴加一抗抗體（小鼠抗人 CD68 抗體 1∶100，小鼠抗人 CD34 抗體 1∶50，小鼠抗人 PCNA抗體 1∶100，小鼠抗人 αSMA抗體 1∶50），每張組織切片滴加200μL，要求完全覆蓋組織，濕室中4℃過夜。④ 滴加二抗：TNT洗滌緩沖液沖洗玻片5 min×3次，滴加相對應(yīng)的二抗抗體（FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG抗體 1∶2 000，Cyanine3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體1∶4 000，Coumarin標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體1∶2 000，Cyanine5標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體1∶3 000），每張組織切片滴加200μL，完全覆蓋組織，室溫孵育45 min后4℃過夜。⑤ 封閉：TNT洗滌緩沖液沖洗玻片5 min×3次，TNB封閉緩沖液每張切片滴加200μL，要求完全覆蓋組織，室溫孵育8 min。⑥ 鏡下觀察：玻片TNT洗滌緩沖液沖洗5 min×3次，無水乙醇脫水，中性樹酯固定，置于熒光顯微鏡下觀察，四種熒光素的最大吸收光波長（前）和最大發(fā)射光波長（后）分別為：Cyanine5（648 nm，667 nm），Cyanine3（550 nm，570 nm），F(xiàn)ITC（402 nm，443 nm），Coumarin（402 nm，443 nm）。ZEN顯微圖像分析軟件合成圖像并計數(shù)。［3－6］

表1 3組一般資料比較（±s）

表1 3組一般資料比較（±s）

組別濕熱證組血瘀證組陽虛證組n 10 10 10年齡／歲75.3±10.1 78.1±11.3 75.1±9.5糖尿病病程／a 18.3±5.3 20.1±6.9 19.5±10.8創(chuàng)面病程／周14.4±5.8 17.3±6.6 16.4±7.4 HbA1c／%7.4±5.1 8.2±4.2 7.9±5.2踝肱指數(shù)0.8±0.2 0.8±0.3 0.8±0.4潰瘍面積／cm2 14.3±4.4 15.3±6.3 13.6±4.1脛前經(jīng)皮氧分壓／mmHg 30.4±7.2 25.6±4.7 28.5±6.1

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 4組皮膚組織MASSON染色情況 ① 正常組皮膚淺層結(jié)構(gòu)清晰，微血管內(nèi)徑大小不等，膠原纖維形態(tài)飽滿，排列欠整齊，微血管外炎癥細(xì)胞極少見。②濕熱證組皮膚淺層微血管、膠原纖維等組織結(jié)構(gòu)尚清晰，微血管內(nèi)徑大小不等，部分有破壞紅細(xì)胞，微血管周圍滿布炎癥細(xì)胞。③ 血瘀證組膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，正常組織結(jié)構(gòu)大部破壞，微血管內(nèi)徑較大，處于擴張狀態(tài)，炎癥細(xì)胞分布。④ 陽虛證組皮膚淺層組織結(jié)構(gòu)大部破壞，膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂嚴(yán)重，微血管及炎癥細(xì)胞較少。見圖1。

圖1 4組皮膚組織MASSON染色圖（×100）

3.2 4組免疫熒光四重染色情況 ① 正常組αSMA＋細(xì)胞位于微血管內(nèi)膜（濕熱證組、血瘀證組、陽虛證組αSMA＋細(xì)胞位于微血管外膜），細(xì)胞粗大飽滿；αSMA＋／PCNA＋細(xì)胞較多；CD68＋細(xì)胞少見；PCNA＋細(xì)胞散見于組織內(nèi)，染色色彩鮮明。②濕熱證組αSMA＋細(xì)胞于CD34＋細(xì)胞外，粗大、增生明顯；CD68＋細(xì)胞滿布，形態(tài)飽滿；PCNA＋細(xì)胞數(shù)量 增加，αSMA＋／PCNA＋、CD68＋／PCNA＋、CD34＋／PCNA＋雙陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，尤以αSMA＋／PCNA＋為甚。③ 血瘀證組CD34＋細(xì)胞數(shù)量可，形態(tài)瘦小而細(xì)，微血管內(nèi)徑廣泛增加，CD34＋／PCNA＋細(xì)胞增多。④ 陽虛證組所有陽性細(xì)胞均較少，CD68＋細(xì)胞罕見；PCNA＋、αSMA＋細(xì)胞少見，形態(tài)瘦小萎縮。見圖2。

圖2 4組創(chuàng)面免疫熒光四重染色圖（×200）

3.3 4組陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞數(shù)比較見表2。

表2 4組陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s） 個／200 視野

表2 4組陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s） 個／200 視野

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與濕熱證組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別正常組濕熱證組血瘀證組陽虛證組n 5 10 10 10 CD68＋細(xì)胞12.0±6.26 183.4±32.81）99.3±46.31）2）36.9±29.41）2）CD68＋／PCNA＋細(xì)胞2.3±1.5 24.4±7.21）4.1±2.11）2）2.4±1.2 αSMA＋細(xì)胞14.3±5.7 67.8±34.21）87.1±23.41）3）21.4±7.21）2）αSMA＋／PCNA＋細(xì)胞4.1±1.2 46.1±13.81）25.2±17.41）5.1±1.7 CD34＋細(xì)胞88.3±23.1 72.8±31.71）114.5±32.81）2）23.1±5.11）CD34＋／PCNA＋細(xì)胞3.2±1.2 33.2±12.51）64.2±22.51）2）01）2）PCNA＋細(xì)胞29.7±16.4 214.6±98.61）235.1±104.71）3）64.7±29.31）2）

4 討論

糖尿病未潰皮膚與非糖尿病比較已存在“隱性損害”，如真皮層厚度明顯變薄，炎性細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞功能和數(shù)量下降［7］。糖尿病伴慢性創(chuàng)面真皮組織中，巨噬細(xì)胞在功能和數(shù)量出現(xiàn)異常［8］，影響對壞死組織及細(xì)菌的清除，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不足，影響創(chuàng)面修復(fù)。成纖維細(xì)胞生長抑制和凋亡百分率顯著高于非糖尿?。?-10］，導(dǎo)致細(xì)胞和基質(zhì)附著的纖維骨架生成減少，肉芽增生也明顯受到影響。糖尿病多伴有下肢微循環(huán)障礙，包括微血管數(shù)量減少，另外在研究中發(fā)現(xiàn)，微血管中內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能也有異常［11］。

創(chuàng)面的修復(fù)是按炎癥、增殖、修復(fù)過程進行的，在不同時期起主要作用的細(xì)胞類型各不相同，它們之間相互依存、促進、制約，如果出現(xiàn)異常，導(dǎo)致創(chuàng)面停滯于修復(fù)的某一階段，繼而引起創(chuàng)面慢性過程。

PCNA只存在于增殖細(xì)胞核內(nèi)，標(biāo)志著細(xì)胞啟動DNA合成和細(xì)胞增殖，從而源源不斷增加創(chuàng)面修復(fù)所需要的蛋白及有關(guān)細(xì)胞，如果細(xì)胞PCNA陽性，就可以認(rèn)為這些細(xì)胞可以在數(shù)量上逐漸增加，反映“正氣”的強弱。

我科以“生肌三法”分類DFCUs，應(yīng)用免疫熒光四重染色技術(shù)，初步分析其病理特點有一定的規(guī)律可循：濕熱證創(chuàng)面巨噬細(xì)胞及其增殖型最多，主要表現(xiàn)為較強的慢性炎癥。血瘀證組中炎癥細(xì)胞明顯少于濕熱證創(chuàng)面，雖內(nèi)皮細(xì)胞在數(shù)量上未見明顯增多，但微血管內(nèi)徑擴大，是以微血管擴張所致瘀滯狀態(tài)為主要特點。陽虛證相關(guān)細(xì)胞及其增殖細(xì)胞數(shù)量上均較其他組少?！吧∪ā崩碚搶?chuàng)面的復(fù)雜性簡單化，DFCUs存在慢性炎癥、循環(huán)瘀滯狀態(tài)、功能下降為突出矛盾的三個不同病理狀態(tài)，符合臨床的特點。

朱紅膏方組成朱砂、紅粉，具有祛腐解毒等功效；紫色疽瘡膏方組成以龍血竭為主藥，配以紫草、赤芍、紅花、血竭等，具有活血化瘀的功效；回陽生肌膏方由肉桂、炮干姜、人參、當(dāng)歸、黃芪、川芎等組成，具有回陽生肌的作用，研究表明，主要是促進巨噬細(xì)胞的功能，啟動炎癥反應(yīng)的作用［12］。

本研究結(jié)果表達慢性創(chuàng)面中的三個病理特征，雖然并不能完全概括創(chuàng)面的復(fù)雜性，但也充分說明生肌三法理論將糖尿病慢性創(chuàng)面依據(jù)局部辨證提出三個證型，代表創(chuàng)面三種不同病理狀態(tài)，臨床上相互轉(zhuǎn)化、影響，各有側(cè)重，根據(jù)局部辨證選擇不同外用中藥，發(fā)揮中醫(yī)外用藥對DFCUs治療作用是相對專一和相對綜合［13-14］，也是中醫(yī)治療疾病的特點之一。