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        細(xì)菌nox基因研究進(jìn)展

        2018-11-23 09:13:26丁承超邱景璇陳國薇謝曼曼
        微生物學(xué)雜志 2018年5期
        關(guān)鍵詞:菌膜突變體毒力

        王 艷, 丁承超, 邱景璇, 陳國薇, 謝曼曼, 劉 箐*

        (1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;2.同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 200092)

        還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)是一種普遍存在于活生物體中的關(guān)鍵輔因子,參與各種代謝及調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的氧化還原反應(yīng)[1],NADH氧化酶(NADH Oxidase,NOX)是一種氧化還原酶,由nox基因編碼。高等動(dòng)植物nox基因編碼的NADH氧化酶是一種多亞基復(fù)合體,包括催化亞基、調(diào)節(jié)亞基和結(jié)合配體[2-3],已在人體中表征的7種催化亞基(NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox-1和Duox-2)被稱為NOX家族[4]。NOX將電子從細(xì)胞內(nèi)的NADH轉(zhuǎn)移穿過膜并將其偶聯(lián)到分子氧,從而產(chǎn)生活性氧(Reacyive Oxygen Species,ROS),除了NOX4能直接產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)[5]之外,其他亞型的NOX都是先產(chǎn)生超氧化物陰離子(O2·-),再由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)將O2·-快速轉(zhuǎn)化為H2O2[6]。正常生理?xiàng)l件下,NOX產(chǎn)生低水平的O2·-或H2O2,但貧血[7]、缺氧[8]、高糖[9]、高血壓[10]等各種病理?xiàng)l件能激活NOX產(chǎn)生大量ROS,NOX衍生的ROS可能導(dǎo)致氧化損傷(如細(xì)胞凋亡和壞死)或作為信號分子,調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖和分化[4,11],另外,當(dāng)機(jī)體被病原體侵襲時(shí)還具有殺菌功能[12]。研究發(fā)現(xiàn),許多細(xì)菌中也存在nox基因,編碼NADH氧化酶,它在調(diào)控微生物代謝方面有重要作用。然而,絕大多數(shù)nox相關(guān)的研究都集中在動(dòng)植物上,細(xì)菌nox基因的研究僅停留在初步階段。詳細(xì)了解細(xì)菌nox基因及其編碼產(chǎn)物NOX的具體作用方式及其對細(xì)胞產(chǎn)生的影響,對研究細(xì)菌生長及其毒力有積極意義。國內(nèi)對細(xì)菌中nox基因的研究相對較少,本文綜述了近年來細(xì)菌中nox基因的研究成果,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對單核細(xì)胞增生李斯特氏細(xì)菌(Listeriamonocytogenes,Lm)nox基因的研究進(jìn)展,對目前存在的問題和未來的發(fā)展進(jìn)行評述。

        1 NADH氧化酶的分類及結(jié)構(gòu)

        1.1 NOX分類

        研究表明,在氧氣存在的條件下,肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)[13]、變形鏈球菌(Streptococcusmutans)[14]及無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[15]等細(xì)菌中的NOX能將電子從NADH(還原形式的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+))轉(zhuǎn)移到O2,直接將O2還原;在無氧條件下,其他電子受體如二氯酚靛酚(dichloro-phenol-indophenol,DCIP)、甲萘醌和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,F(xiàn)AD)[14,16]等,也可以用作NOX的底物,在NADH存在時(shí)被還原。

        目前關(guān)于NOX的具體分類沒有明確的定義。綜合各類文獻(xiàn)表述,一般可根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的不同,將NOX分為三類:一類為H2O2型NOX,反應(yīng)過程中2個(gè)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移產(chǎn)生H2O2[16];另一類就是狹義的NOX即H2O型NOX,反應(yīng)過程中有4個(gè)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移產(chǎn)生H2O[17];還有一類O2-型NOX,反應(yīng)過程中有1個(gè)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移產(chǎn)生O2-[18]。具體反應(yīng)式如下:

        NADH+H++O2→NAD++H2O2

        2NADH+2H++O2→2NAD++2H2O

        NADH+H++2O2→NAD++H++2O2-

        通過代謝氧氣并調(diào)節(jié)NADH/NAD+的比例,NOX可以調(diào)控多個(gè)下游靶標(biāo),涉及酸應(yīng)激和氧化應(yīng)激、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝和菌膜形成的多個(gè)基因,對菌體生長和毒性有至關(guān)重要的作用。

        表1 10株細(xì)菌中NADH氧化酶序列對比Table 1 Sequence alignment of NADH oxidase among 10 bacteria strains

        1.2 NOX氨基酸序列分析

        盡管NOX分子的來源不同,但一級結(jié)構(gòu)具有普遍類似性,C端均有核黃素蛋白FAD結(jié)合域和NADH結(jié)合域。表1為本文所涉及的10種細(xì)菌NOX的氨基酸序列與Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e的對比結(jié)果。經(jīng)分析,NOX的氨基酸序列在細(xì)菌中較為保守,相似性均在30%以上,其中,糞腸球菌V583(EnterococcusfaecalisV583)的NOX的氨基酸序列與Lm-EGD-e高度相似,達(dá)到99%。

        以表1所涉及的10株細(xì)菌NOX的氨基酸序列構(gòu)建生物進(jìn)化樹如圖1所示。進(jìn)化樹上顯示糞腸球菌V583與Lm-EGD-e親緣關(guān)系最近。

        圖1 基于NOX氨基酸序列構(gòu)建10株細(xì)菌的進(jìn)化樹Fig.1 NJ phylogenetic tree based on amino acid sequence of NADH oxidase in this 10 strains of bacteria

        目前關(guān)于NOX在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的定位還不明確,綜合各類文獻(xiàn)報(bào)道,厭氧菌主要產(chǎn)生H2O2型NOX,存在于細(xì)胞膜上或胞內(nèi),兼性厭氧菌(大部分是乳酸菌)主要產(chǎn)生H2O型NOX,且蛋白存在于胞內(nèi)。2013年Muchnik等[24]使用鼠抗rNOX抗血清將野生型肺炎鏈球菌染色,并通過流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果顯示NOX位于細(xì)胞表面的細(xì)胞壁,且nox缺失菌株表面未檢測到該蛋白。2017年Zhao等[28]在研究牛分枝桿菌(Mycoplasma bovis)的NOX相關(guān)功能時(shí),使用抗rNOX單克隆抗體做探針,顯示NOX是膜相關(guān)蛋白,在培養(yǎng)基上清液中不存在;使用Signal IP和TMHMM服務(wù)器進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明NOX沒有跨膜結(jié)構(gòu)域或信號肽。

        對Lm的nox基因及NOX做了初步研究,圖2為使用TMHMM Server v. 2.0分析軟件對Lm中NOX的跨膜分析及定位預(yù)測,結(jié)果表明Lm中的NOX不可能為跨膜蛋白。

        1.3 NOX結(jié)構(gòu)

        2016年Titov等[21]在人上皮瘤細(xì)胞中表達(dá)并篩選了幾種H2O型NOX,其中來自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的nox基因表達(dá)量最高。將LbNOX的C端以FLAG-tag標(biāo)記、N端以His-tag標(biāo)記并在大腸埃希菌中過表達(dá),測得其分子大小為(197±4) kD。圖3為Titov 等以X射線測定的短乳桿菌中的NOX的晶體衍射圖,分辨率為2.4 ?[21]。

        圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌EGD-e的NOX的TMHMM跨膜分析Fig.2 TMHMM transmembrane analysis for NADH Oxidase (NOX) of Listeria monocytogenes EGD-e

        圖3 短乳桿菌中黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴型的H2O型NOX的催化二聚體的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 Crystal structure of the catalytic dimer of the flavin adenine dinucleotide(FAD)-dependent H2O-forming NADH oxidases from Lb

        2 nox基因的功能

        2.1 nox基因影響細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激

        細(xì)菌普遍具有代謝氧的能力,氧在電子傳遞鏈中作為電子受體并通過氧化磷酸化生成ATP,防止有害代謝產(chǎn)物的生成[29]。然而,細(xì)胞呼吸過程可導(dǎo)致活性氧(ROS)的產(chǎn)生,ROS 是生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱,包括超氧自由基(O2-) 、羥基陰離子(OH-) 、過氧化氫(H2O2)等[30]。正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和消除是平衡的,然而,當(dāng)ROS過量積累或受到某些環(huán)境脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡偏向氧化的一方,形成氧化壓力[31]。ROS反應(yīng)活性較高,易與其他分子發(fā)生反應(yīng),可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA和膜脂質(zhì)的損傷以及酶失活,或直接激活細(xì)胞凋亡信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        細(xì)菌發(fā)展出各種應(yīng)對呼吸過程中有害代謝產(chǎn)物的解毒機(jī)制,人們已表征了許多與消除ROS相關(guān)的酶,包括SOD、NOX、過氧化物酶、過氧化氫酶、烷基氫過氧化物酶以及谷氧還原蛋白與硫氧還原蛋白體系[32]。有研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌nox突變體的基因芯片與添加外源氧的菌體有相似的特點(diǎn)[33],表明NOX參與了細(xì)胞的氧解毒過程。實(shí)際上在鏈球菌中,NOX發(fā)生高度保守的氧代謝機(jī)制,通過每次轉(zhuǎn)移1個(gè)電子,將氧還原為H2O或H2O2,同時(shí)將NADH氧化為NAD+,參與酸應(yīng)激和氧化應(yīng)激[34]。

        Yamamoto等[15]研究發(fā)現(xiàn),無乳鏈球菌nox缺失菌株在高氧、百草枯(生成ROS)和過氧化氫(導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng))存在的條件下,分別表現(xiàn)出生長減緩、停滯及存活率下降,即使向培養(yǎng)基中加入還原劑(如谷胱甘肽或DTT)、TIRON(消除百草枯生成的O2-)或過氧化氫酶(降解H2O2),也不能減輕nox突變體的生長缺陷,表明nox基因影響了細(xì)菌的氧化應(yīng)激能力。相似的研究表明NOX在肺炎鏈球菌的致病機(jī)制中有重要作用,有氧環(huán)境下缺失nox基因?qū)?dǎo)致生長速率降低[13,35];高氧條件下,化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)nox突變體在葡萄糖限制培養(yǎng)基中不能生長,且對百草枯敏感性增強(qiáng)[36];有氧條件下,變形鏈球菌nox突變體的NAD+再生受阻影響了替代的混合酸發(fā)酵途徑,在甘露醇及山梨糖醇培養(yǎng)基的生長狀態(tài)大大降低[14]。

        另一方面,Li等[37]構(gòu)建了干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiLC2W)nox重組菌株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)厭氧條件下,nox過表達(dá)菌株的生長速率更慢且最終細(xì)胞密度也更小,表明氧化還原狀態(tài)對細(xì)胞代謝具有顯著影響。實(shí)際上早在2006年,Heux等[38]已提出過表達(dá)NOX可能會(huì)過量消耗NADH,胞內(nèi)降低的NADH水平及NADH/NAD+比值導(dǎo)致糖酵解通量減少,從而影響細(xì)胞生長。

        綜合上述分析,缺失nox會(huì)影響細(xì)菌的氧化應(yīng)激能力,對有害ROS表現(xiàn)出消極反應(yīng),改變細(xì)菌的生長和毒力;過表達(dá)NOX又會(huì)過多消耗胞內(nèi)NADH,對細(xì)菌的有機(jī)物代謝途徑產(chǎn)生影響,進(jìn)一步影響細(xì)胞狀態(tài)。由此得出NOX的主要功能是氧化NADH并還原氧以保護(hù)細(xì)胞免受自由基形成的損害,其次是對糖代謝有促進(jìn)作用。

        2.2 nox基因影響菌膜形成及功能

        幾乎所有微生物都具有黏附到物體或混合菌落表面的機(jī)制,生物膜普遍存在并有助于細(xì)菌抵抗非生物因素脅迫、抗菌劑以及宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。美國國家衛(wèi)生研究院2003年的一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,80%以上的微生物感染都與生物膜有關(guān)[39]。細(xì)菌被包裹在由胞外多糖(EPS)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸組成的胞外基質(zhì)中[40],細(xì)菌的黏附和聚集作用均與生物膜基質(zhì)密切相關(guān)[41]。

        2016年Ge等[16]使用共聚焦激光掃描顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),厭氧條件下的血鏈球菌(Streptococcussanguinis)nox突變體在不同成分基質(zhì)(不論是非生物還是生物)表面上形成的生物膜的量均顯著少于野生型,且結(jié)構(gòu)差異也非常大。實(shí)驗(yàn)菌株之間沒有顯著的生長差異,表明生物膜改變不是生長差異導(dǎo)致的,證實(shí)了nox基因確實(shí)參與血鏈球菌中的生物膜形成。

        另外,膜流動(dòng)性對于保持菌膜的性質(zhì)和膜蛋白的功能至關(guān)重要,如脂質(zhì)雙層的滲透性、蛋白質(zhì)流動(dòng)性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和主動(dòng)運(yùn)輸過程等[42-46]。細(xì)菌eDNA在生物膜形成及分散中發(fā)揮重要作用[47],膜流動(dòng)性改變可能影響細(xì)菌eDNA與胞外生物膜基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、易位或裝配。有研究表明膜流動(dòng)性與脂肪酸組成有關(guān)[48],研究者認(rèn)為不飽和脂肪酸(順-異油酸)的減少可能會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低[42]。

        Ge等[16]發(fā)現(xiàn)厭氧條件下血鏈球菌nox缺失導(dǎo)致eDNA含量顯著降低,膜中C16脂肪酸含量增加,C18脂肪酸減少,熒光各向異性表明突變體的膜流動(dòng)性降低,與上述猜測一致。Yamamoto等[15]的研究表明,有氧條件下nox突變體的缺陷主要是由于總脂肪酸產(chǎn)量減少所導(dǎo)致,且突變體中的NAD+含量的降低可能影響乙酰-CoA(脂肪酸生物合成的前體)產(chǎn)生。

        菌膜作為一種抗逆性強(qiáng)的生存和增殖方式,極有可能在細(xì)菌生長受到較強(qiáng)抑制時(shí)菌膜形成能力反而增強(qiáng),形成菌膜需要多種基因協(xié)調(diào)作用,調(diào)控菌體生長代謝及群體感應(yīng)等。總的來說,缺失nox基因一定程度上從菌膜豐度、脂肪酸總量及比例等方面改變了菌膜形成,對細(xì)胞膜功能產(chǎn)生影響。

        2.3 nox基因影響細(xì)菌生長、菌間競爭能力

        多個(gè)研究表明nox基因?qū)?xì)菌、菌間及致病菌與宿主的相互作用有重要影響。Gei等[16]通過pJFP96質(zhì)粒轉(zhuǎn)化驗(yàn)證了即使加入硫酸軟骨素4磺基轉(zhuǎn)移酶(Chondroitin 4 Sulfotransferase,CSP),質(zhì)粒在血鏈球菌nox突變體中的轉(zhuǎn)化依舊受到顯著抑制。不同于Auzat等[13]在肺炎鏈球菌中看到的,僅當(dāng)不添加CSP時(shí),pJFP96質(zhì)粒在nox突變體中的轉(zhuǎn)化效率才顯著下降。DNA轉(zhuǎn)化頻率與細(xì)菌生長能力相關(guān)[49-50],由pJFP96質(zhì)粒在不同菌株中的轉(zhuǎn)化效率的差別,可從分子水平上解釋nox基因影響菌體生長能力的作用機(jī)制。

        通常血鏈球菌、戈登鏈球菌(Streptococcusgordonii)等過氧化口腔鏈球菌會(huì)產(chǎn)生殺菌水平的H2O2以抑制變形鏈球菌的生長[48]。Baker JL等[51]對變形鏈球菌進(jìn)行種間競爭能力測定,發(fā)現(xiàn)有氧條件下nox突變體生長能力中等損傷,厭氧條件下則不受抑制,表明NOX可能僅對有氧環(huán)境中變形鏈球菌的競爭能力有影響,且對H2O2敏感可能是導(dǎo)致競爭缺陷的主要原因。Ge等[52]反向評估了nox基因?qū)ρ溓蚓c變形鏈球菌競爭能力的影響,表明野生型血鏈球菌在BHI平板接觸區(qū)域明顯抑制變形鏈球菌生長,而nox突變體失去抑制能力。以上研究驗(yàn)證了nox基因影響鏈球菌消除有害H2O2的能力,缺失nox在一定程度上降低了其生長能力及菌間競爭能力。

        2.4 nox基因影響細(xì)菌對宿主的黏附及毒力

        不論是食品學(xué)還是臨床醫(yī)學(xué),致病菌形成菌膜并就近黏附于固相載體都對其傳播起到積極作用,細(xì)菌的黏附能力是體現(xiàn)毒力的重要因素。

        Zhao等[28]通過電鍍法檢測牛分枝桿菌nox缺失菌株對胚胎牛肺(EBL)細(xì)胞的黏附能力,發(fā)現(xiàn)缺失菌株黏附量顯著降低,且rNOX蛋白和抗rNOX抗血清都能不同程度抑制野生型牛分枝桿菌對EBL細(xì)胞的黏附,由此推測,牛分枝桿菌NOX是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附的細(xì)菌黏附素。Muchnik等[24]比較了肺炎雙球菌nox缺失菌株和野生型菌株在小鼠體外肺上皮細(xì)胞上的黏附程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)nox缺失菌株的黏附能力顯著下降,并且rNOX和兔抗rNOX抗血清都能不同程度地抑制野生型肺炎鏈球菌對肺源腺癌細(xì)胞系的黏附,再一次證明了NOX可能作為黏附素介導(dǎo)肺炎鏈球菌對宿主細(xì)胞的黏附作用。

        相同的研究將肺炎雙球菌nox缺失菌株接種于小鼠的鼻、咽和肺部,回收到的nox缺失菌株顯著減少,且小鼠的存活率顯著上升,表明nox缺失菌株的毒力降低。有多個(gè)研究顯示,在肺炎鏈球菌和無乳鏈球菌中,缺失nox基因?qū)е录?xì)菌在嚙齒動(dòng)物呼吸道、敗血癥和中耳炎感染模型中的毒力減弱[13,15];在血鏈球菌中,nox突變體在兔心內(nèi)膜炎感染模型中的毒力減弱[52];在屎腸球菌(Enterococcusfaecium)中,缺失nox基因?qū)е缕湓诰€蟲蠕蟲秀麗隱桿線蟲感染模型中的殺傷活性顯著降低[53]。

        與上面結(jié)果相反的是,本實(shí)驗(yàn)室以不同Lm菌株侵襲人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco2)和人肝癌細(xì)胞(HepG2),以流式細(xì)胞術(shù)檢測被Lm侵襲后的Caco2和HepG2的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)nox缺失菌株可誘導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡,nox過表達(dá)菌株相反;另外,我們檢測了細(xì)胞產(chǎn)生的超氧化物和H2O2,發(fā)現(xiàn)與其他菌株相比,當(dāng)細(xì)胞被nox缺失株侵襲時(shí)ROS水平反而下降,相對應(yīng)的細(xì)胞炎癥因子也被抑制。一系列實(shí)驗(yàn)表明Lm的nox缺失株似乎表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力,這是與已知的其他細(xì)菌nox基因功能相反的結(jié)果,有待進(jìn)一步驗(yàn)證[54]。

        綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論,nox突變體在血液中生存率降低可能是動(dòng)物感染模型中毒力改變的原因之一,另一種可能性是nox突變體對宿主細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平變化有影響,從而改變了宿主對病原菌的抵抗能力。這些結(jié)論提示可以將nox作為研究靶點(diǎn),探究致病菌毒力調(diào)控的分子機(jī)制,從而為解決致病機(jī)理、細(xì)菌抗藥性等問題提供可能性。

        2.5 nox基因影響代謝產(chǎn)物生成

        NOX位于多個(gè)調(diào)節(jié)途徑的交集,其本身也被這些途徑調(diào)節(jié)。細(xì)菌糖酵解過程N(yùn)AD+轉(zhuǎn)化為NADH,而NOX將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+以維持NAD+/NADH比例的平衡,從而對糖酵解過程的進(jìn)行起重要作用。

        Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)有氧條件下干酪乳桿菌nox重組菌株過表達(dá)NOX時(shí),NADH參與丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸過程,過度消耗NADH,乳酸鹽產(chǎn)量急劇下降,導(dǎo)致更多碳源進(jìn)入外多糖EPS的生物合成途徑。有氧條件下乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)過表達(dá)NOX時(shí),胞內(nèi)NADH/NAD+比例降低,葡萄糖分解代謝過程中的全同型發(fā)酵轉(zhuǎn)化為混合酸發(fā)酵[14,55-56]。Felipe等[57]也提出乳酸桿菌中輔因子NADH/NAD+平衡的調(diào)節(jié)會(huì)轉(zhuǎn)移碳通量減少乳酸的產(chǎn)生,并有利于其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。Yamamoto等[15]發(fā)現(xiàn)盡管nox突變體在有氧條件下的生長受到影響,但大多都正常地管理中樞能量代謝,如糖酵解(盡管葡萄糖消耗速率稍微降低),然而,nox突變體似乎不能進(jìn)行一些支鏈代謝途徑,即涉及乙酸鹽和乙偶姻生產(chǎn)的支鏈。

        3 展 望

        nox基因在高等動(dòng)植物體中的研究已趨于成熟,但在細(xì)菌中的研究少之又少,目前僅在19 種細(xì)菌中報(bào)道了nox基因。Patchett等在研究Lm(NCTC 7973)氧化代謝過程中,通過外源加入NADH的方法,首次證實(shí)Lm中存在NOX活性[58],但在目前已報(bào)道的19 種菌中卻不包含Lm,基于此對Lm的nox基因的功能做了初步研究,但經(jīng)過同源性對比,發(fā)現(xiàn)其和高等動(dòng)植物的nox基因同源性較低,另外其在細(xì)菌生長毒力方面的作用也與已知的19種細(xì)菌有所差異[54]。

        已發(fā)表的文獻(xiàn)表明細(xì)菌nox參與調(diào)節(jié)毒力,然而nox的確切功能仍然是有爭議的,一些研究發(fā)現(xiàn)缺失nox導(dǎo)致一些細(xì)菌的毒力降低,但也有研究表明相反的結(jié)果。迄今為止?jié)撛诘淖饔脵C(jī)制仍不清楚,并且可能在不同的細(xì)菌之間是不同的。我們認(rèn)為當(dāng)病原菌進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí),宿主細(xì)胞可以識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),一旦識別入侵細(xì)菌,宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS以抵抗細(xì)菌感染,稱之為氧化爆發(fā)[59]。為了確保在宿主細(xì)胞中存活,許多病原菌已經(jīng)發(fā)展出抑制ROS產(chǎn)生的機(jī)制,也許nox基因也參與了宿主-病原菌的相互作用之中。

        綜上所述,NOX廣泛存在于細(xì)菌中,其除了最基本的氧化還原活性之外,還存在其他作用,是一種重要的與毒力相關(guān)的因子。其中,文獻(xiàn)已明確指出NOX通過調(diào)節(jié)氧氣和NAD+水平,涉及調(diào)控氧化還原傳感調(diào)節(jié)劑REX和轉(zhuǎn)錄因子SPX等蛋白質(zhì),從而影響全局調(diào)節(jié)途徑。缺失nox基因?qū)е录?xì)胞在氧化應(yīng)激反應(yīng)、菌膜形成、毒力等方面的各種缺陷,且代謝途徑發(fā)生顯著改變[60-61]。

        高等動(dòng)植物中的nox基因主要參與機(jī)體的防御機(jī)制,并調(diào)節(jié)生長和發(fā)育,其表達(dá)的NADH氧化酶是一種與膜和胞漿相關(guān)的多酶復(fù)合體。近年來對細(xì)菌中nox基因及其編碼的NOX的研究正在逐漸深入,在微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科均取得了一定成果,但多數(shù)研究集中在nox基因與細(xì)菌宏觀生長、毒力、代謝等之間的相關(guān)性,NOX具體的定位、作用方式和作用通路尚不明確。

        有研究指出,細(xì)菌菌膜與細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性及致病力增強(qiáng)相關(guān)[62],nox基因?qū)ば纬傻挠绊懣赡苁且粋€(gè)突破點(diǎn),深入解析菌膜形成過程中的分子調(diào)控機(jī)制,有助于更好地理解細(xì)菌形成菌膜的生存方式以及開發(fā)和研制新型高效的抗菌劑和藥物,或者結(jié)合預(yù)測微生物學(xué)、微生物風(fēng)險(xiǎn)評估等研究方法,可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)療器械及食品安全等方面。

        還有一些研究表明,NOX起到黏附素作用,可以作為致病菌的抗原決定簇引起小鼠的特異性免疫應(yīng)答,由于其與人序列同源性較低且在細(xì)菌中比較保守,未來可以將其作為某些蛋白質(zhì)疫苗的候選者。又由于NOX作為一種重要的毒力相關(guān)因子,缺失nox基因會(huì)在一定程度上降低致病微生物對宿主的毒性,有必要研究nox基因在動(dòng)物宿主感染模型中的作用機(jī)制,考慮其作為減毒疫苗的可能性。

        另外,由于NOX作為輔因子參與各種代謝及調(diào)節(jié)系統(tǒng)的反應(yīng),通過工程化調(diào)控NOX的再生水平,可以改變代謝通量,從而優(yōu)化各種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。

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