廖何斌， 徐 磊， 楊國淋， 馬 強,2,， 鄒 江， 孫 茹， 蔡 燕,2,， 郭曉蘭,2,*

(1.川北醫(yī)學院 轉化醫(yī)學研究中心，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 檢驗科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗系，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學院 動物實驗中心，四川 南充 637000)

鼠傷寒沙門氏菌屬于腸桿菌科，沙門氏菌屬，是一種腸道致病菌，營胞內(nèi)寄生，能通過多種途徑逃避宿主的免疫系統(tǒng)，在宿主體內(nèi)較長時間存活并造成持續(xù)感染。由于其宿主廣泛，能感染包括人在內(nèi)的多種動物，能通過定殖在腸道相關組織有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，容易表達外源抗原或其他蛋白等并呈遞給宿主，使宿主產(chǎn)生特異性抗體，所以鼠傷寒沙門氏菌常被改造為弱毒疫苗活載體，廣泛應用于多種病毒[1-3]、細菌[4-6]、寄生蟲[7-8]等的免疫研究，并取得了良好的效果。此外，鼠傷寒沙門氏菌也被應用于多種腫瘤治療的研究[9]，其中VNP20009株已用于一期臨床試驗[10-11]。在弱毒疫苗活載體研究中，鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)常被用于細胞學實驗和動物學實驗，所以對其進行信號標記，使其可視化，將有利于相關的實驗研究。在動物實驗中，利用LUX系統(tǒng)對細菌進行標記，在活體成像系統(tǒng)中便能實時檢測細菌在動物體內(nèi)的分布及轉移情況。發(fā)光桿菌的Lux operon編碼5個相關蛋白，包括LuxA、LuxB、LuxC、LuxD和LuxE，其中LuxA和LuxB組成異源二聚體，構成熒光素酶，LuxC、LuxD和LuxE編碼脂肪酸還原酶復合體，熒光素酶氧化底物FMNH2和長鏈脂肪醛生成FMN和長鏈脂肪酸，同時產(chǎn)生生物光現(xiàn)象，長鏈脂肪酸又能被脂肪酸還原酶還原為長鏈脂肪醛[12]。所以，能表達完整Lux operon的細菌不需要外源底物便能持續(xù)產(chǎn)生生物發(fā)光。這種生物發(fā)光信號即使在動物組織的深部也能被檢測到，所以是一種非常方便有效的小動物活體檢測技術[13-14]。綠色熒光蛋白(GFP)是一類存在于腔腸動物的生物發(fā)光蛋白，由于其生色基團的形成沒有物種特異性，所以在原核和真核細胞都能合成有功能的GFP蛋白，GFP蛋白也被廣泛應用于多學科的研究和生產(chǎn)中。GFP蛋白有諸多優(yōu)點，包括易于檢測、靈敏度高、蛋白質穩(wěn)定、熒光性質穩(wěn)定、對細胞無毒害作用、能與其他多種蛋白融合表達且不影響兩者的功能、能用于活細胞檢測等[15]。在細胞水平研究細菌，GFP是一種理想的細菌標記物，只需要熒光顯微鏡便能檢測到細菌在細胞內(nèi)的定殖和轉移情況。本研究擬對鼠傷寒沙門氏菌強毒株SalmonellatyphimuriumATCC 14028s進行化學發(fā)光和綠色熒光的雙標記。使其同時能在動物水平和細胞水平具有較好的可視化，為其后續(xù)的改造改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌種與細胞株 質粒p1217由西北農(nóng)林科技大學王華巖教授惠贈；質粒pRE112、大腸埃希菌7213和7232由四川農(nóng)業(yè)大學孔慶科教授惠贈；鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s(Salmonellatyphimurium)由本實驗室保存；食管癌細胞TE1和乳腺癌細胞468(MDA-MB-468)由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 一步克隆試劑盒pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、PCR試劑盒TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase Kit、內(nèi)切酶BamHI購自北京全式金生物公司；質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；RPMI1640購自Gibco；氯霉素(Cm)、青鏈霉素、胎牛血清(FBS)、二氨基庚二酸(DAP)、蔗糖購自Sigma；Marker 10000購自康維試劑。

1.2 方法

1.2.1 自殺質粒的構建 根據(jù)GenBank收錄的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s的基因組序列，選擇兩個特定的位點，分別設計擴增同源臂I1-U、I1-D、I2-U、I2-D的引物Insert1 UP1/UP2、Insert1 DP1/DP2、Insert2 UP1/UP2、Insert2 DP1/DP2；根據(jù)質粒p1217和pRE112序列，分別設計擴增Lux操縱子的引物LUX P1/P2，擴增綠色熒光蛋白基因gfp的引物GFP P1/P2，擴增質粒pRE112的引物112 P1/P2，序列及產(chǎn)物理論長度見表1。用PCR試劑盒，按照使用說明書擴增各DNA片段，再用DNA純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物；用一步克隆試劑盒按順序將I1-U、LUX、I1-D以及BamHI酶切-回收的pRE112等4個片段進行重組，或按順序將I2-U、GFP、I2-D和112等4個片段進行重組；重組產(chǎn)物轉化到大腸埃希菌7232中，在LB+Cm(20 μg/mL)平板進行篩選，提取陽性轉化子中的重組質粒pRE112-I1和pRE112-I2進行測序鑒定，序列無誤則克隆成功。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in this study

1.2.2 基因插入細菌基因組 基因插入利用同源重組的原理。首先將構建的自殺質粒pRE112-I1和pRE112-I2轉化到接合轉移供體大腸埃希菌7213中，在LB+Cm+DAP(50 μg/mL)平板中篩選陽性轉化子；分別將陽性轉化子7213 pRE112-I1(或7213 pRE112-I2)和S.typhimurium野生株(WT)液體震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照2∶1的比例混合兩種菌液，取500 μL菌液濃縮后涂布于LB平板，37 ℃孵育8 h，刮取菌體，涂布于LB+Cm篩選陽性接合子；將陽性接合子接種于LB+Cm液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，稀釋50倍，取100 μL涂布于LB+Sucrose(10%)平板，室溫培養(yǎng)；PCR鑒定長出的菌落是否為基因插入的菌株，陽性菌落的PCR產(chǎn)物進行DNA測序以確定插入序列正確。

1.2.3 生長曲線測定 接種S.typhimuriumWT、S.typhimuriumLux和S.typhimuriumLux-gfp于2 mL LB中，過夜培養(yǎng)；分別稀釋100倍接種于15 mL LB中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)；每1 h測定一次OD600值，共培養(yǎng)8 h。分別進行3次獨立實驗。

1.2.4 動物實驗 購買體重相近的SPF級5周齡雌性BalB/C小鼠30只，隨機均分為10組；在LB中培養(yǎng)接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp至對數(shù)生長期，分別稀釋至適當濃度，取0、103、104、105、106和107CFU的活菌(懸于100 μL 生理鹽水)腹腔注射小鼠；各組小鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房，自由采食、飲水，光照12 h，飼養(yǎng)15 d，計算S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp對BalB/C小鼠的LD50。當小鼠需要活體成像時，用45 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射以麻醉小鼠，用小動物活體成像系統(tǒng)顯影。

1.2.5 細胞實驗 食管癌細胞TE1培養(yǎng)于RPMI1640+10%FBS，乳腺癌細胞468培養(yǎng)于DMEM+10%FBS，均在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每種細胞接種105個細胞于6孔板中，S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用RPMI1640洗滌并調整濃度，分別用1.5×108個CFU細菌與每孔中的細胞孵育2 h，去除細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞，然后添加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入100 μg/mL的慶大霉素。

2 結果與分析

2.1 S. typhimurium Lux-gfp構建及其表型

通過分析S.typhimuriumATCC 14028s的基因組，選擇基因組上的兩處位置(圖1)，這兩處位置的特點是均在兩側編碼基因的下游區(qū)域，且和兩側編碼基因均不在同一操縱子內(nèi)部，在理論上避開了啟動子區(qū)域，不會對相鄰的基因造成極效應。首先根據(jù)插入位點的序列設計了相應同源臂擴增引物，根據(jù)p1217和pRE112序列設計引物擴增Lux operon和gfp基因。PCR擴增結果如圖2所示，各PCR產(chǎn)物條帶與Marker進行比較，均符合其理論值大小(表1)。利用一步克隆法將各個片段依次進行無縫連接，構建成重組的自殺質粒，經(jīng)測序鑒定構建成功?；谕粗亟M的原理，用構建的重組自殺質粒先后在基因組對應的位點插入Lux operon和gfp基因，對應的菌株分別獲得了化學發(fā)光和綠色熒光的特性。如圖3所示，野生型S.typhimuriumWT不具備化學發(fā)光和綠色熒光特性；S.typhimuriumLux獲得了化學發(fā)光特性，S.typhimuriumLux-gfp同時獲得了化學發(fā)光和綠色熒光的特性，表明成功構建了化學發(fā)光-綠色熒光標記的鼠傷寒沙門氏菌。在體外進行了超過20代的培養(yǎng)，該菌株仍保持穩(wěn)定的基因型和表型特征(數(shù)據(jù)未展示)，這與插入的DNA片段在染色體上穩(wěn)定遺傳是相符的，也是相對于質粒攜帶外源DNA的優(yōu)勢所在。

圖1 基因組插入位點Fig.1 The insertion sites

圖2 重組自殺質粒片段擴增Fig.2 The amplification of fragments used to construct suicide plasmid

圖3 化學發(fā)光-紫外熒光檢測Fig.3 The detection of chemiluminiscence and ultraviolet fluorescence

2.2 穩(wěn)定遺傳的S. typhimurium Lux-gfp生長特性和毒力

為了確定在S.typhimurium基因組中插入一段序列后對細菌的影響，對構建菌株進行了生長曲線測定，結果見圖4。結果表明，在基因組上2個獨立位點先后插入兩段基因序列，并未對細菌的生長造成顯著影響；繼續(xù)測定S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp對5周齡BalB/C小鼠的半數(shù)致死量，均小于2×103CFU，表明S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp毒力均極強。

鼠傷寒沙門氏菌常作為疫苗載體遞呈內(nèi)源性和外源性的抗原進行免疫，或者作為基因治療載體針對某些疾病進行治療等，這往往依賴其生長迅速，操作簡單，以及強毒力使其在宿主體內(nèi)進行適當?shù)母腥九c定殖等特征。測定了S.typhimuriumWT、Lux和Lux-gfp的生長曲線，各菌間均無顯著性差異，結果表明Lux operon和gfp基因的插入并未顯著影響其快速的生長和極強的毒力，所以S.typhimuriumLux-gfp作為親本株進行各種基因工程改造，在研究細菌的生命活動、細菌與宿主的相互作用、減毒活疫苗載體研發(fā)等領域比S.typhimuriumWT更具優(yōu)勢。

圖4 生長曲線測定Fig.4 The growth of S. typhimurium WT, Lux and Lux-gfp

2.3 S. typhimurium Lux-gfp在細胞內(nèi)的熒光信號

在S.typhimurium基因組中插入gfp基因，使得該菌具備綠色熒光的特性，在平板上生長的菌落，紫外熒光明顯(圖3)，進一步檢測在細胞水平下該菌的熒光情況。鼠傷寒沙門氏菌是胞內(nèi)侵襲菌，能入侵到細胞內(nèi)部。用S.typhimuriumLux-gfp感染食管癌細胞TE1和乳腺癌細胞468約15 h后在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖5所示，感染了S.typhimuriumLux-gfp的細胞內(nèi)部有明顯的綠色熒光。被S.typhimuriumLux-gfp感染的細胞形態(tài)均有變圓趨勢，易漂浮死亡，這可能是由于該菌株毒力強，對細胞殺傷力大造成的。若要作為疫苗載體或者基因治療載體，則應該使其毒力弱化，減小對正常細胞的殺傷作用；或使進入細胞的細菌裂解以釋放基因治療藥物等，這樣才能更好地發(fā)揮作為載體的作用。

2.4 S. typhimurium Lux-gfp在活體小動物上的化學發(fā)光信號

在S.typhimurium基因組中插入Lux operon，使得該菌有化學發(fā)光的特性，在平板上生長的菌落具有良好的化學發(fā)光能力(圖3)，化學發(fā)光特性可用作小動物活體成像，所以進一步在BalB/C小鼠體內(nèi)進行化學發(fā)光的檢測。高劑量攻毒(107CFU)的小鼠，全身感染，2 d死亡，化學發(fā)光成像如圖6所示。未攻毒的對照組小鼠，同時間的化學發(fā)光成像如圖6所示。結果表明，構建的菌株S.typhimuriumLux-gfp在含有正常皮毛的BalB/C小鼠體內(nèi)的化學發(fā)光信號能被檢測到，那么在裸鼠的效果將更明顯?；瘜W發(fā)光信號可由小動物成像系統(tǒng)采集信號，也可以用普通的化學發(fā)光顯影儀采集信號，對儀器的要求不高，大部分實驗室均能完成。所以，菌株S.typhimuriumLux-gfp在動物實驗中提供了易操作的可視化手段。

圖5 S. typhimurium Lux-gfp感染TE1和468細胞Fig.5 The infection of S. typhimurium Lux-gfp in cancer cells: TE1 and 468

圖6 S. typhimurium Lux-gfp感染小鼠Fig.6 The infection of S. typhimurium Lux-gfp in BalB/C mouse

3 討 論

使細菌帶有化學發(fā)光特性的操縱子Lux op-eron和綠色熒光基因gfp被廣泛應用于微生物學和分子生物學的各個領域。通常是由質粒作為載體攜帶Lux operon或gfp基因進入細菌表達，這樣則會由于外源質粒的引入同時代入1～2種抗生素抗性基因，這是作為疫苗載體或治療載體的細菌應盡量避免的；質粒具有不穩(wěn)定性，可能會丟失；而且由于質粒不相容性，這些質粒的存在將增加該菌株表達外源目的蛋白或核酸質粒的選擇難度。因此，本研究直接將Lux operon或gfp基因通過同源重組的方式插入S.typhimuriumATCC 14028s基因組中，這樣不引入任何外源抗性基因，又能保證兩種標記能得到穩(wěn)定的表達，其在體外傳代20代以上均十分穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未展示)，而且還避免了引入質粒帶來的其他問題。在基因組中插入的外源基因相對質粒攜帶的缺點在于目的基因的單拷貝，其表達量受到極大的限制。本研究結果表明，這種單拷貝的標記基因表達量能使其表現(xiàn)型達到被檢測的水平，既在紫外光和化學發(fā)光檢測儀器檢測到該菌的菌落具有紫外發(fā)光和化學發(fā)光特性，同時該菌感染癌細胞后，在細胞水平也能檢測到綠色熒光信號，在感染的小鼠體內(nèi)也能檢測到化學發(fā)光信號。細菌基因組插入一段序列后可能會帶來極效應，即對插入位點下游基因的表達造成影響，所以插入Lux operon或gfp基因的位點均選擇在兩端基因相隔較遠，且同時在兩端基因的下游區(qū)域，這樣理論上不會影響到上下游基因的啟動子，不會對其表達造成影響。此外，還檢測了雙信號菌株的生長曲線和毒力，與親本株比較無顯著性差異，側面說明了Lux operon或gfp基因的插入并未造成極效應。

在基因組中穩(wěn)定標記化學發(fā)光-綠色熒光信號的基因是完全可行的，本研究構建的化學發(fā)光-綠色熒光穩(wěn)定標記的鼠傷寒沙門氏菌將為后期改造其作為弱毒活疫苗載體或抗腫瘤載體的研究提供可視化手段，同時為相關的細菌信號檢測研究提供理論參考。