柏淑禹 孫靜

鮑曼不動桿菌作為主要的革蘭陰性非發(fā)酵菌,分布廣泛,臨床分離率高,可借助攜帶多個耐藥基因的移動元件,如整合子快速獲得多重耐藥[1]。2005～2014 年,鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率由 31.0 % 逐步上升至 66.7 %, 并在部分地區(qū)造成醫(yī)院內(nèi)流行[2]。 本研究通過分析老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌攜帶整合子的狀況,研究菌株的同源性,為防治老年科耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的感染及流行提供一定的理論及實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集本院老年科2014年3月至2017年3月住院病人臨床分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌28株。其中痰液21份,尿液、分泌物各3份,胸水1份,無重復(fù)分離株。

1.2 主要試劑和儀器 Taq Mix、DNA marker為DBI公司產(chǎn)品;GN13藥敏板卡、哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板為梅里埃公司產(chǎn)品;亞胺培南西司他汀鈉為美國默沙東公司產(chǎn)品;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物由金斯瑞公司合成;GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn) 所有菌株均經(jīng)ATB32GN鑒定條(法國梅里埃公司產(chǎn)品)鑒定。藥敏試驗(yàn)應(yīng)用K-B紙片擴(kuò)散法, 結(jié)果按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(NCCLS 2001版)判讀。

1.4 整合子PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分析 整合子及可變區(qū)基因檢測依據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成Ⅰ類整合酶基因(Intl Ⅰ)與Intl Ⅱ及可變區(qū)基因擴(kuò)增引物,見表1。細(xì)菌DNA提取采用TaKaRa公司試劑盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR),于-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增體系20μL:上、下游引物各1μL(10μmol/L),2×Taq DNA Master Mix 10μL,ddH2O 7μL,模板1μL。PCR擴(kuò)增參數(shù):95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉公司測序,測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。

表1 Intl及可變區(qū)基因擴(kuò)增引物

1.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 試驗(yàn)菌株進(jìn)行了MLST 分型,MLST引物操作及MLST序列型(STs)分析見 www.pasteur.fr/mlst 網(wǎng)站。MLST分型使用7 個基因(表2)。PCR擴(kuò)增體系見前述。反應(yīng)條件: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃45 s,30個循環(huán),72 ℃ 7 min。產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果在上述網(wǎng)頁進(jìn)行比對,并得出菌株的ST分型。

表2 鮑曼不動桿菌MLST分型引物序列

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ類整合子耐藥基因盒擴(kuò)增結(jié)果 28株耐亞胺培南鮑曼不動桿菌中,10株(35.7%)攜帶Intl Ⅰ,所有菌株均未擴(kuò)增出Ⅱ類和Ⅲ類Intl 。對Intl Ⅰ陽性菌株進(jìn)一步檢測Ⅰ類整合子基因盒類型,10株皆擴(kuò)增出可變區(qū)耐藥基因盒,DNA測序分析整合子可變區(qū)攜帶2種基因盒,6株為aacC1-orfx′-aadA1(2542 bp),4株為aacA4-catB8-aadA1(2378 bp)。擴(kuò)增電泳見圖1。

M:DNA標(biāo)志物; 1～2:intl;3: aacC1-orfx′-aadA1(2542bp); 4: aacA4-catB8-aadA1(2378bp)圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 MLST分子分型結(jié)果 28株鮑曼不動桿菌被分為4個ST 型。ST1145 型14 株(50.0%),ST1417 型 5株(17.9%),ST195 型 4 株(14.3%),ST540 型 3 株(10.7%),未分型2株(7.1%)。其中ST1415型占總菌株數(shù)的一半,是老年病科的主要流行類別,廣泛分布于老年科4個病區(qū)。

3 討論

老年病房是院內(nèi)感染的高發(fā)地。老年病人基礎(chǔ)疾病復(fù)雜,長期住院,免疫力低下,加之鮑曼不動桿菌的生物學(xué)特征,使其成為多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的高發(fā)人群。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥,通常對其他抗菌藥物也表現(xiàn)為高耐藥,已是共識。鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜,如滅活酶的產(chǎn)生、孔蛋白的缺失、藥物主動外排泵的過度表達(dá)、青霉素結(jié)合蛋白的改變等。耐藥基因通過一些可移動的基因元件，如整合子、質(zhì)粒等,在菌株之間水平轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的迅速出現(xiàn)及傳播。

本研究顯示,我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌攜帶Ⅰ類整合子的陽性率為34.5 %, 低于國內(nèi)相關(guān)報(bào)道[3],考慮與細(xì)菌基因型別及地區(qū)藥物選擇性差異有關(guān)。對10株Intl Ⅰ陽性株進(jìn)一步檢測可變區(qū),6株擴(kuò)增出2542 bp、4株擴(kuò)增出2378 bp的可變區(qū)耐藥基因盒,分別為aacC1-orfx′-aadA1及 aacA4-catB8-aadA1。aacC1導(dǎo)致慶大霉素耐藥,aadA1導(dǎo)致鏈霉素和壯觀霉素耐藥,aacA4導(dǎo)致阿米卡星、奈替米星和妥布霉素耐藥, catB導(dǎo)致氯霉素耐藥,Ⅰ類整合子參與了分離菌株的耐藥及多重耐藥。不同地區(qū)耐藥基因盒種類有所差異,Chen等[4]對華東地區(qū)多重耐藥鮑曼不動桿菌的研究顯示,aacA4+catB8+aadA1和dfrXII+orfF+aadA2比率分別為84.3%、15.6%。我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌對其他種類抗生素的耐藥情況,整合子的作用還有待進(jìn)一步研究。

不同國家與地區(qū),碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌流行序列有所差異。近年來,ST2 序列型成為歐洲地區(qū)、我國云南某地區(qū)的主要流行株。本研究中,MLST結(jié)果顯示,28株鮑曼不動桿菌菌株中,ST1145型14株,是我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的主要流行型別,其次為ST1417型5株、ST195、ST540基因型各3株。考慮老年病房存在耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的感染傳播,提示我們必須加強(qiáng)感染隔離及控制,并對病房環(huán)境、物體表面嚴(yán)格消毒,以防止醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

本研究提示,我院老年病房存在產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌的流行,進(jìn)一步開展詳細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查、采取必要的防控措施及合理應(yīng)用抗生素是當(dāng)務(wù)之急。